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A20 단백질 매개 Snail1 단백질 다중모노유비퀴틴화를 통한 전이성 유방암의 암전이 기전 연구

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    2017-12-01
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A20 단백질 매개 Snail1 단백질 다중모노유비퀴틴화를 통한 전이성 유방암의 암전이 기전 연구

A20 promotes metastasis of aggressive basal-like breast cancers through multi-monoubiquitylation of Snail1

Nat Cell Biol 19(10):1260-1273, 2017

 

 

 

 

 

이지형
성균관대학교 자연과학대학

wlgud1990@skku.edu

정수명
메사추세츠 의과대학 
SuMyung.Jung@umassmed.edu

박석희
성균관대학교 자연과학대학

parks@skku.edu

 

 

 

연구배경

 

여섯 가지의 유방암 아형 중 Basal-Like 유방암은 Basal/Myoepithelial 마커를 발현하고 있으며 대다수의 경우 ER, PR, HER2 단백질에 대하여 음성이다. 이러한 Basal-Like 유방암은 재발률이 높고 다른 장기로의 전이가 자주 발생하는 등 매우 악성의 성질을 나타내며 다른 아형에 비해 매우 좋지 못한 예후를 보이는 특징을 갖는다 (그림 1) (1).

 

 

 

그림 1. 원격 재발에 대한 위험율 (1)

삼중음성 유방암(ER-, PR-, HER2-)과 비삼중음성 유방암의 암 진단 후 원격 재발에 대한 위험률을 분석한 그래프

 

 

 

A20 단백질은 염증과 면역반응의 중요 조절자이며 탈유비퀴틴 활성, E3 유비퀴틴 연결 효소 활성을 함께 가지고 있고 또한 유비퀴틴 결합 단백질로도 알려져 있어 유비퀴틴 편집 효소로 알려져 있다 (2, 3). 염증과 면역반응에서의 역할이 잘 알려진 것과 다르게 A20 단백질은 여러 암 세포주에서는 암을 유발하는 인자로 보고되기도 하고 B 세포 림프종에서는 암 억제자의 역할로 보고되기도 하는 등 아직까지 암과 관련하여 A20 단백질의 기능이 명확하게 밝혀져 있지 않고 있다 (4, 5).

상피-중간엽 전이(Epithelial-Mesenchymal Transition; EMT)는 암의 진행에 있어서 암세포의 침투와 전이에 연관성이 높으며 Snail Family(Snail1, Snail2, Snail3), ZEB Family(ZEB1, ZEB2), Basic Helix-Loop-Helix Family(Twist1, Twist2)와 같은 전사인자들에 의해서 조절이 된다. 이중 Snail1 단백질은 가장 연구가 많이 되어 왔으며, TGF-β, Hypoxia, ROS 등에 의해 발현이 증가하고 GSK3β 단백질, SCF-β-TrCP 단백질 복합체 등에 의해서 제거되는 것으로 알려져 있다 (6).

A20 단백질과 Snail1 단백질의 기능이 염증반응과 EMT 현상에서 각각 잘 알려져 있지만 A20 단백질이 Snail1 단백질과 연계하여 암형성, 침투 및 전이에 어떻게 관여하는지는 알려지지 않았다. 본 연구진은 Basal-Like 유방암 아형에서 과발현 되어있는 A20 단백질이 핵에서 Snail1 단백질의 다중모노유비퀴틴화를 유도하여 안정화시킴으로써 TGF-β-유도 EMT와 관련되어 있으며 전이성이 강한 Basal-Like 유방암의 전이를 촉진하는 것을 본 논문에서 규명하였다.

 

 

 

연구결과

 

1.   Basal-Like 유방암에서 과발현 되어있는 A20

 

유방암의 전이에 관여하는 E3 유비퀴틴 결합효소 또는 탈유비퀴틴화 효소를 동정하기 위해 본 연구진은 몇 가지 인간 유방암 세포주에서 RNA Sequencing을 수행하였다. 그 결과, A20 유전자의 발현이 Basal-Like 유방암 세포주에서 유의미하게 과발현 되어있음을 확인하였고 Immunoblot을 통해 재확인하였다 (그림 1a, 1b). 유방암 진행의 각 단계를 모방하는 MCF10A 세포주 시리즈에서도 일반 유방 상피 세포인 M1 세포주에서 가장 전이성이 높은 M4 세포주로 갈수록 A20 단백질 발현이 증가하는 것을 또한 확인하였다 (그림 1c). 52가지 유방암 세포주로부터 분석된 Public Microarray Data Set을 활용하여 A20 유전자의 발현이 Basal-Like 유방암 세포주에서 높게 발현되어 있는 것을 확인하였고 TCGA Data Set을 분석하여 유방암 환자 조직에서도 Basal-Like 아형에서 A20 유전자가 과발현 되어 있음을 확인하였다 (그림 1d-1f).

 

 

그림 2. 전이성 유방암에서 과발현 되어 있는 A20 유전자

  (a, b)Luminal 아형과 Basal 아형의 유방암 세포에서 A20 단백질의 발현을 RNA-Sequencing (a) Immunoblot (b)을 통해 분석하였다. (c)서로 다른 전이능력을 갖고 있는 MCF10A-유래 세포주의 Lysates에서 A20의 발현을 Immunoblot을 통해 분석하였다. (d)Gene Expression Omnibus(GEO) Data Set을 활용하여 서로 다른 52가지의 유방암 세포주에서 유방암 아형에 따른 A20 유전자의 발현을 비교분석 하였다. (e, f)TCGA Data Set을 활용하여 유방암 아형에 따른 유방암 환자 조직에서의 A20 발현을 Microarray (e) RNA-Seq (f)을 통해 분석하였다.

 

 

 

 

2. TGF-β-유도 EMT에 필수적인 A20

 

A20의 발현이 전이성 유방암인 Basal-Like 아형에서 과발현 되었으므로 본 연구진은 A20 TGF-β-유도 EMT에 연관되어 있을 것이라는 가설을 세우고 실험을 진행하였다. A20 Knockdown된 마우스 젖샘 세포주인 NMuMG 세포주와 인간 유방 상피 세포주인 MCF10A 세포주를 제작하여 TGF-β 처리에 따른 EMT Morphology와 마커 단백질 발현 변화를 확인하였다 (그림 3). A20-Knockdown 세포주에서는 TGF-β를 처리하여도 EMT-유사 형태적인 변화가 나타나지 않았으며(그림 3a, 3b), Immunofluorescence Immunoblot을 통해 분석하였을 때에도 Epithelial 마커 단백질인 E-Cadherin 감소와 Mesenchymal 마커 단백질인 N-cadherin, Vimentin, Fibronectin, α-Smooth Muscle Actin의 증가가 나타나지 않는 것을 확인하였다 (그림 3c-3e). A20-Knockdown NMuMG 세포주와 MCF10A 세포주에서 공통적으로 Snail1 단백질의 발현이 감소하였고 TGF-β1을 처리하였을 때, A20 단백질의 발현이 유의미하게 증가하는 것이 확인되었다 (그림 3d, 3e). 이러한 결과들은 A20 Snail1을 조절함으로써 TGF-β1-매개 EMT에 관여할 것임을 유추할 수 있는 결과이다.

 

 

그림 3. TGF-β-유도 EMT에 관여하는 A20

(a, b)마우스 젖샘 세포주인 NMuMG 세포주 (a)와 인간 유방 상피 세포주인 MCF10A 세포주 (b)에서 A20 발현을 Knockdown한 후, TGF-β 처리에 따른 EMT Morphology를 현미경으로 관찰하였다. (c)A20 발현이 KnockdownNMuMG 세포주에서 TGF-β 처리에 따른 EMT 마커 단백질의 발현 변화를 Immunofluorescence를 통해 확인하였다. (d, e)A20 발현이 Knockdown NMuMG 세포주 (d) MCF10A 세포주 (e)에서 TGF-β 처리에 따른 EMT 마커 단백질의 발현과 EMT 중요 전사 조절 인자 단백질의 발현을 Immunoblot을 통해 분석하였다.

 

 

 

 

3. A20에 의한 Snail1 단백질 안정화

 

Snail1의 전사가 TGF-β/Smad 신호전달 경로에 의해 유도되기 때문에 본 연구진은 A20 TGF-β/Smad 신호전달을 통해 Snail1 발현을 증가시키는지를 확인하였다 (그림 4). A20-knockdown NMuMG 세포주와 MCF10A 세포주에서 Immunoblot을 통해 분석한 결과 Smad 단백질들의 인산화정도 및 발현양과 TGF-β/Smad 신호전달을 통해 발현이 증가하는 것으로 알려진 또 다른 단백질인 PAI1의 발현이 대조군과 비교하였을 때 차이가 없었고 Snail1 단백질 발현만이 감소되어 있는 것을 확인하였다 (그림 4a, 4b). Quantitative RT-PCR을 통해 Snail1 mRNA 수준을 분석해본 결과 단백질과는 달리 Snail1 mRNA는 대조군과 A20-Knockdown 세포주 사이에 큰 차이가 없는 것을 확인하였고 (그림 4c), 이러한 결과는 A20 Knockout MEF 세포를 이용한 실험에서도 동일함을 확인하였다 (그림 4d, 4e). A20 Knockout MEF 세포주에 A20 발현을 플라스미드를 통해 복원시켰을 때, Snail1 단백질 발현양이 WT MEF 세포주의 수준으로 회복되었으며 단백질 합성을 저해하는 Cycloheximide(CHX)를 처리하였을 때, Snail1 단백질의 안정성이 A20 Knockout MEF 세포주에서 크게 감소하는 것을 확인하였다 (그림 4f, 4g). 이러한 결과는 A20 Snail1을 단백질 수준에서 안정화 시키는 것을 증명하는 결과이다.

 

 

그림 4. A20에 의한 Snail1 단백질의 안정화

(a, b)A20-Knockdown NMuMG 세포주와 MCF10A 세포주에서 Immunoblot을 통한 TGF-β/Smad 신호전달 단백질 발현 변화를 분석하였다. (c)A20-Knockdown NMuMG 세포주에서 qRT-PCR을 통한 Snail1 mRNA 수준을 분석하였다. (d, e)A20 Knockout MEF 세포주를 통해 TGF-β/Smad 신호전달 단백질 발현과 Snail1 mRNA 수준을 분석하였다. (f)A20를 발현하는 플라스미드를 이용하여 A20 Knockout MEF 세포주에 A20를 발현시킨 후, Snail1 단백질 발현을 Immunoblot을 통해 분석하였다. (g)WT A20 Knockout MEF 세포주에 CHX를 처리하여 Snail1 단백질의 안정성을 분석하였다.

 

 

 

 

4. A20에 의한 유방암 세포의 폐로의 전이 촉진

 

위의 결과를 토대로 본 연구진은 유방암 세포의 병적인 진행에 있어서 A20의 생체 내 기능을 밝히고자 실험을 진행하였다. Luciferase를 과발현하는 마우스 유방암 세포주인 4T1-Luc 세포주에 A20 유전자가 Knockdown된 세포주를 제작하여 마우스의 젖샘에 동소이식하여 암 형성 및 암 전이 마우스 모델을 구축하였다 (그림 5). 주 차별로 광자 배출량을 측정하여 이식된 암세포의 증식 및 암 전이 정도를 측정해본 결과 대조군과 비교하여 A20-Knockdown 세포주의 암 증식 능력에는 차이가 없었지만 폐로의 전이가 확연히 감소하는 것을 확인하였으며 마우스의 폐에 형성된 전이암 결절의 수에 있어서도 A20-Knockdown 세포주를 이식한 마우스 그룹에서 결절의 수가 매우 적게 나타남을 확인하였다 (그림 5a-5c).

 

 

그림 5. A20에 의한 유방암 세포의 폐로의 암전이 촉진

  Luciferase를 과발현하는 마우스 유방암 세포주인 4T1-Luc 세포주에 A20Knockdown한 세포주를 구축하여 마우스의 젖샘에 동소이식하여 암 형성 및 암 전이 모델을 만들어 암의 진행 정도를 광자 배출량을 측정하여 확인하였고 (a), 폐에 형성된 전이암 결절의 수를 측정하였다 (b, c).

 

 

 

5. A20에 의한 Snail1의 다중모노유비퀴틴화

 

 A20가 어떻게 분자적으로 유방암의 전이를 촉진하는지 확인하기 위해 A20 단백질과 Snail1 단백질의 상호작용을 확인하였다. Immunoprecipitation을 통해 과발현 수준과 Endogenous 수준에서 A20 Snail1 단백질이 상호작용하고 있음을 확인하였고 TGF-β1을 처리하였을 때, 상호작용이 강해지는 것을 확인하였다 (그림 6a, 6b). A20가 유비퀴틴 편집 효소로 알려져 있었기 때문에 A20 발현에 따른 Snail1 단백질의 유비퀴틴화 패턴을 분석 하였다. 그 결과, A20가 함께 발현되었을 때, Snail1 단백질이 모노유비퀴틴화 된 것으로 보이는 크기의 밴드가 진해지는 것을 확인 하였고 이러한 패턴의 밴드가 in vitro 실험에서도 재현 되는 것을 확인함으로써 A20에 의해 Snail1 단백질이 직접적으로 모노유비퀴틴화 되는 것을 확인하였다 (그림 6c, 6d). 또한 기존에 A20 E3 접합 효소 활성이 있는 것으로 알려진 아미노산 잔기를 돌연변이 시킨 플라스미드를 제작하여(2, 3) 실험을 진행하였을 때, A20 ZnF7 도메인에 존재하는 770번 페닐알라닌과 771번 글라이신 잔기가 Snail1의 모노유비퀴틴화와 단백질 안정화에 중요한 것을 확인하였다 (그림 6e).

 

 

그림 6. A20 ZnF7 도메인에 의한 Snail1의 모노유비퀴틴화 유도

(a, b)HEK293 세포주를 이용한 과발현 시스템 (a) NMuMG 세포주의 Endogenous 수준 (b)에서 Immunoprecipitation을 통해 A20 Snail1 단백질의 상호작용을 확인하였다. (c, d)Ni-NTA Pulldown 시스템을 통해 A20에 의한 Snail1의 유비퀴틴 패턴 분석 (c)in vitro 유비퀴틴화 실험을 통한 A20에 의한 Snail1의 모노유비퀴틴화를 확인하였다 (d). (e) A20 Mutant 플라스미드를 이용하여 Snail1을 모노유비퀴틴화 시키는 A20 단백질의 아미노산 잔기를 동정하였다.

 

 

 

6. 유방암전이에 중요한 Snail1 단백질의 세 개의 라이신 잔기

 

 Snail1 단백질에는 N-말단의 Seine-Rich 도메인과 C-말단의 Zinc-Finger 도메인에 총 14개의 라이신 잔기가 존재하기 때문에 본 연구진은 각각의 도메인의 라이신 잔기들이 모두 아르기닌으로 치환된 N-6KR, C-8KR Mutant 플라스미드를 제작하였다 (그림 7a). 이 플라스미드를 NMuMG 세포주에 발현한 후, Pulldown을 진행하여 Snail1의 모노유비퀴틴화를 분석한 결과, C-8KR Mutant의 모노유비퀴틴화가 감소하는 것을 확인하였고, C-말단에 존재하는 각각의 라이신 잔기를 아르기닌으로 치환시킨 플라스미드를 이용하여 A20에 의한 단백질 안정화 정도를 분석하였을 때, 206, 234, 235번의 라이신 잔기가 아르기닌으로 치환되었을 때, A20에 의한 단백질 안정화가 일어나지 않는 것을 확인하였다 (그림 7b, 7c). 위의 세 개의 라이신 잔기가 아르기닌으로 동시에 치환된 3KR Mutant를 제작하여 실험한 결과 C-8KR Mutant와 동일한 수준으로 Snail1의 모노유비퀴틴화와 단백질 안정성이 감소하는 것을 확인하였다 (그림 7d). 동물 모델 실험을 통해 이러한 세 개의 라이신 잔기가 유방암 세포의 전이에 있어서도 중요함을 최종적으로 확인하였다 (그림 7e-7g).

 

 

 

그림 7. 유방암 전이에 중요한 Snail1 단백질의 세 개의 라이신 잔기 동정

(a, b)Snail1 N-말단과 C-말단에 존재하는 라이신 잔기를 모두 아르기닌으로 치환한 mutant를 제작한 후 (a), Ni-NTA Pulldown을 진행하여 Snail1의 모노유비퀴틴화를 분석하였다 (b). (c, d)Snail1 C-말단에 존재하는 각각의 라이신을 아르기닌으로 치환 후 A20 플라스미드의 발현에 따른 Snail1 단백질의 안정화를 분석하여 세 개의 라이신 잔기를 동정하였고 (c), 동정한 세 개의 라이신 잔기가 아르기닌으로 치환된 3KR Mutant를 제작하여 C-8KR과 동일하게 Snail1의 모노유비퀴틴화와 안정화가 일어나지 않음을 확인하였다 (d). (e-g)동물 모델 실험을 통해 동정한 세 개의 라이신 잔기의 유방암 전이에 있어서의 중요성을 확인하였다.

 

 

 

7. A20 매개 Snail1 모노유비퀴틴화의 GSK3β 매개 Snail1 인산화 저해

 

 A20에 의한 Snail1 모노유비퀴틴화가 어떻게 Snail1 단백질을 안정화 시키는지 분자적 기전을 분석하기 위해, Snail1을 제거하는 주요 단백질인 GSK3β와 Snail1의 관계에 A20가 미치는 영향을 분석하였다. NMuMG 세포주에 TGF-β1을 처리함에 따라 대조군에서는 A20 Snail1의 상호작용이 증가하며 GSK3β와 Snail1의 상호작용은 감소하였지만 A20-Knockdown 세포주에서는 GSK3β와 Snail1의 상호작용이 더 증가하며 TGF-β1을 처리하여도 유지가 되는 것을 확인하였다 (그림 8a). A20에 의해 모노유비퀴틴화가 일어나지 않는 3KR Mutant를 이용하여 실험한 결과, WT의 경우 A20 발현에 의해 GSK3β와의 상호작용이 감소하며 GSK3β 매개 인산화가 감소하였지만 3KR의 경우 A20가 발현되어도 GSK3β와의 상호작용과 인산화가 유지되는 것을 확인하였다 (그림 8b, 8c). Immunofluorescence를 통해 이러한 A20 Snail1의 상호작용이 TGF-β1 처리에 따라 핵 내에서 강하게 일어남을 확인함으로써 (그림 8d), A20에 의한 Snail1의 모노유비퀴틴화가 핵에서 일어나며 GSK3β에 의한 상호작용을 저해하여 Snail1 단백질을 안정화 시키는 분자적 기전을 확인하였다.

 

 

 

그림8. A20에 의한 GSK3β 매개 Snail1 인산화 저해

  (a)TGF-β1 처리에 따른 Snail1 A20 GSK3β와의 상호작용을 NMuMG 세포주에서 확인하였다. (b, c)A20에 의해 모노유비퀴틴화가 일어나지 않는 3KR mutant를 이용하여 A20에 의한 Snail1 모노유비퀴틴화가 Snail1 GSK3β와의 상호작용 (b) GSK3β 매개 Snail1 인산화 (c)에 어떠한 영향을 주는지 분석하였다. (d)Immunofluorescence를 통해 A20 Snail1의 상호작용이 세포 내 어떠한 소기관에서 나타나는지를 분석하였다.

 

 

 

 

연구의 성과 및 의의

 

본 연구진은 Basal-Like 유방암의 전이와 TGF-β 매개 EMT에서 A20의 역할을 본 논문을 통해 확인하였다. 그러므로, 본 연구진의 연구는 면역 조절자인 A20 EMT 매개 전이 현상을 연결하는 하나의 경로를 강력하게 제시할 수 있는 성과라고 할 수 있다. TNF-α에 의해서 유도되는 것으로 기존에 알려진 것과 더불어 본 연구진의 결과는 A20 TGF-β1에 의해 발현이 증가하여 암의 진행에 중요한 역할을 하는 것을 제시한다. A20의 발현은 유방암의 바이오마커로써 이미 잘 알려진 Snail1과 더불어 유방암 환자의 전이와 생존율을 예측하는 진단을 위한 바이오마커로써 활용될 것으로 기대된다. 비록 A20 발현 증가에 의한 환자의 좋지 못한 예후와 A20 발현과 임상결과와의 상관성이 TGF-β1-유도 EMT 현상이 잘 나타나는 유방암에 특이적으로 나타나는 것처럼 보이지만, Snail1을 모노유비퀴틴화 할 수 있는 또 다른 E3 유비퀴틴 결합 효소가 다른 암에서 존재할 것으로 사료되므로 다른 악성 종양에서 이러한 역할을 하는 효소를 찾아내는 연구를 하는 것이 매우 의미 있을 것으로 생각된다.

결과적으로, 본 연구진의 연구는 Snail1의 다중모노유비퀴틴화를 통한 TGF-β 매개 EMT의 조절 기전뿐만 아니라 전이성이 높은 Basal-Like 유방암의 전이에 있어서 A20의 기능을 밝힌 결과라고 할 수 있다 (그림 9). TGF-β 매개 EMT에서 A20-Snail1이라는 축의 조절은 유방암의 전이를 억제할 수 있는 치료제 개발에 있어서 하나의 target이 될 수 있을 것으로 예상된다.

 

           

 

그림 9. A20에 의한 Snail1 단백질 안정화에 대한 분자적 기전 모식도

  A20 단백질이 핵 내에서 Snail1의 세 개의 라이신 잔기(K206, K234, K235)에 모노유비퀴틴화를 시키면 Snail1 단백질은 GSK3β와 상호작용이 감소하여 GSK3β 매개 인산화가 일어나지 않고 세포질로의 이동이 일어나지 않는다. 따라서 세포질에서 SCF-β-TrCP1 복합체에 의해 일어나던 K48-매개 다중모노유비퀴틴화가 일어나지 않으므로 결과적으로 Snail1 단백질이 안정화된다.

 

 

 

 

참고문헌

 

1. Foulkes, W.D., Smith, I.E., Reis-Filho, J. S. (2010) Triple-negative breast cancer. N Engl J Med 363, 1938-1948.

2. Wertz, I. E., O’Rourke, K. M., Zhou, H., Eby, M., Aravind, L., Seshagiri, S., Wu, P., Wiesmann, C., Baker, R., Boone, D. L., Ma, A., Koonin, E. V., Dixit, V. M. (2004). De-ubiquitination and ubiquitin ligase domains of A20 downregulate NF-κB signaling. Nature 430, 694-699.

3. Skaug, B., Chen, J., Du, F., He, J., Ma, A., Chen, Z. J.,. (2011). Direct, non-catalytic mechanism of IKK inhibition by A20. Mol Cell 44, 559-571.

4. Vendrell, J. A., Ghayad, S., Ben-Larbi, S., Dumontet, C., Mechti, N., and Cohen, P. A. (2007). A20/TNFAIP3, a new estrogen-regulated gene that confers tamoxifen resistance in breast cancer cells. Oncogene 26, 4656-4667.

5. Chu, Y., Vahl, J. C., Kumar, D., Heger, K., Bertossi, A., Wójtowicz, E., Soberon, V., Schenten, D., Mack, B., Reutelshöfer, M., Beyaert, R., Amann, K., van Loo, G., and Schmidt-Supprian, M. B cells lacking the tumor suppressor TNFAIP3/A20 display impaired differentiation and hyperactivation and cause inflammation and autoimmunity in aged mice. Blood 117, 2227-2236.

6. Lamouille, S., Xu, J., Derynk, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Biol 15, 178-196.

 

 

 

 

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