생화학분자생물학회

면역 센서 MDA5 의 ISG15 의존적인 활성과 

이를 회피하는 SARS-CoV-2의 분자 기전 규명

ISG15-dependent activation of the sensor MDA5 is antagonized by the SARS-CoV-2 papain-like protease to evade host innate immunity

Nature Microbiology. 6(4):467-478, 2021

이정현

독일 울름대학교 분자 바이러스학과 프로젝트 리더

jung-hyun.lee@uni-ulm.de 

연구 배경

바이러스 감염으로 인한 숙주 면역 시스템의 항상성 교란은 병원체 또는 위험 관련 분자 패턴을 감지하는 선천성 면역 시스템의 수용체에 의해 모니터링 된다¹. RIG-I 유사 수용체 (RIG-I-like receptor, RLR)인  RIG-I와 MDA5는 바이러스 또는 바이러스 감염으로 인해 숙주로부터 생성되는 면역 시스템을 활성화하는 RNA 들을 세포질에서 인지하여 바이러스를 감지하는 중요한 역할을 한다. C-말단 도메인 (CTD) 에서의 RNA 결합과 RIG-I 와 MDA5의 헬리카아제 ( helicase)는 그들의 신호 전달 체계를 위한 여러 효소를 단계별로 활성화한다. 이러한 효소들은 RLR의 단백질 수식화 (post-translational modification, PTM)를 사용하여 여러 도메인에서 RLR의 활성을 조절하는데 특히, 신호 모듈인 Caspase activation and recruitment domains (CARDs) 부분에서의 조절이 활발히 연구됐다. 활성화되는 효소 중 하나인 PP1 α/γ는 RIG-I와 MDA5의 CARD 들을 탈인산화한다².  RIG-I의 경우 탈인산화는 TRIM25 및 기타 E3 ligase에 의한 CARD의 K63- 폴리 유비퀴틴화를 촉진하여 RIG-I의 올리고머 형태를 안정화시켜 MAVS와의 결합을 가능하게 한다³. 그러나 지금까지는 RIG-I와 다르게 MDA5 활성화 단계와 이를 조절하는 PTM에 대해 잘 알려지지 않았다. 기본적으로 RLR 활성화는 유형 I 및 III 인터페론들 (interferons, IFNs)의 생성 후 이를 통해 인터페론 유도형 유전자 (IFN-stimulated genes, ISGs)를 상향 조절하여 항바이러스 신호 체계를 유도한다^4,5. 그 중 ISG15는 표적 단백질 lysine 잔기에 ISG15을 공유 결합시킬 수 있는 유비퀴틴 유사 단백질이며, 이 PTM과정을 ISGylation이라 한다. ISG15 결합이 항바이러스성 면역에 기여하는 점은 알려져 있지만⁶ ISG15의 광범위한 항바이러스 활성을 설명할 수 있는 숙주 단백질 ISGylation의 분자 기작은 현재까지 알려져 있지 않다. 또한, 현재 진행 중인 코로나-19 대유행의 원인 바이러스인 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SCoV2) 는 IFN에 의한 항바이러스 반응을 억제하는 탁월한 능력을 갖추고 있으며, SCoV2에 감염된 환자의 낮은 IFN 생산은 심각한 질병과 연관된다고 알려져 있다⁷. 코로나바이러스의 IFN 억제 기작을 유도하는 단백질 중에 탈 유비퀴틴과 탈 ISGylation 활성을 갖는 papain-like protease (PLpro) 단백질이 있다^8,9. 이에 본 연구진은 바이러스 감염 시 항바이러스 면역을 위해 MDA5 활성을 위한 필수 PTM이 ISGylation임을 밝히고, SCoV2 PLpro가 MDA5에 결합하여 탈 ISGylation 과정을 통해 항바이러스 면역 반응을 회피하는 분자 기작을 규명하여 SCoV2가 MDA5에 의한 면역 감시를 피하기 위해 이미 진화했음을 밝혔다. 

연구 결과

1. MDA5활성은 RIG-I와 달리 ISGylation이 필요하며, 2CARD 부분의 lysine 23과 43에서 일어난다.

MDA5활성을 조절하는 PTM을 알아내기 위하여 GST-pull down assay와 액체 크로마토그래피와 결합된 탠덤 질량 분석법 (LC–MS/MS)을 이용한 결과, MDA5 신호 모듈 2CARD 부분에 ISG15가 결합해 있음을 확인하였다 (그림1A). 이 결합이 ISG15의 공유 결합인 ISGylation임을 확인하기 위해 ISG15유전자가 제거된 (knockout, KO) HeLa 세포에 야생형 (Wild type ,WT) ISG15 또는 ISG15 공유 결합에 필요한 두 glycine들을 alanine 잔기들로 대체한 ISG15 돌연변이 (ISG15-AA)를 재구성한 세포를 이용하여 MDA5의 ISGylation을 입증했다 (그림 1B). 또한, MDA5 ISGylation 과정이 MDA5 활성 촉진제인 고분자 (HMV)-poly(I:C)와 댕기 (DENV) 및 지카바이러스 (ZIKV) 감염시에 내생적으로 일어남을 밝혔다 (그림1C). 이러한 ISGylation과정이 정확히 MDA5 2CARD 부분 어느 잔기에서 일어나는지 알아보기 위해 2CARD 부분의 모든lysine들을 arginine으로 개별 대체시켜 실험하였다. 그 결과 23번과 43번 lysine잔기에 ISGylation이 일어남을 관찰하고, 이 두 잔기 모두에 돌연변이 (Lys23Arg/Lys43Arg)를 가지고 있는 MDA5경우  ISGylation이 거의 일어나지 않음을 밝혀 MDA5 2CARD 부분 중 lysine 23과 43잔기가 ISGylation에 필수적임을 증명하였다 (그림1D). 우리는 다음으로 ISGylation과정이 MDA5의 항바이러스성 신호 전달 체계 조절에 중요한지 알아보기 위해 연구를 진행하였다. 우리는 WT 배아 섬유아세포에서 MDA5 발현양에 비례하게 IFN-β​ 생성된 반면 ISG15 유전자가 제거된 세포 (Isg15-/-) 에서는 IFN-β 생성이 제대로 되지 않음을 관찰하였다 (그림1E).  이와는 달리 RIG-I 경우에는 WT 와 Isg15-/- 세포에서 비슷한 양의 IFN-β을 생성하였다. 우리는 다음으로 이미 널리 알려진 MDA5와 RIG-I의 활성을 촉진하는 리간드를 이용하여 내인성 MDA5와 RIG-I의 활성화에 대한 ISG15의 중요도를 평가하였다. MDA5활성 촉진제인 뇌심근염 바이러스 (EMCV) RNA또는 고분자 (HMV)-poly(I:C)의 자극으로 인한 IFN-β​​ 생성은 Isg15-/-세포에 현저히 억제되었지만, RIG-I의 활성 촉진제인 광견병 바이러스의 leader RNA (RABVLe) 발현 또는 센다이 바이러스 (SeV) 감염에 의해서는 차이가 없었다 (그림 1F). 이를 통해 우리는 ISGylation이 RIG-I 와 달리 MDA5의 신호 전달 체계 활성에 필수적이라는 것을 증명하였다. ​

2. ISGylation은 MDA5 올리고머 형성을 촉진하고 이를 통한MDA5 신호 전달 체계 활성화는 바이러스 복제를 제한한다.

우리는 RLR활성화 과정인 RNA결합, RLR 올리고머화 및 세포질에서 미토콘드리아로의 전위 과정들 중 ISGylation이 MDA5 활성화를 위해 어떤 과정에 기여하는지 알아보기 위한 연구를 진행하였다. 그 결과, WT세포에서 EMC RNA자극이 MDA5 올리고머화를 효과적으로 유도한 반면  Isg15-/-세포에서는 형성되지 않음을 관찰하였다. 또한, lysine 23번과 43번에 돌연변이를 가진 MDA5 (Lys23Arg/Lys43Arg)는 올리고머를 형성하지 못한다는 사실을 통해 ISGylation은 MDA5신호 전달 체계 활성화를 위한 MDA5의 올리고머 형성에 관여한다는 사실을 밝혔다 (그림 2A). 또한 우리는 더 나아가 MDA5 ISGylation이 바이러스 감염 시 이들의 복제를 제한하기 위해 필요한지 연구하였다. 그 결과, WT MDA5는 ZIKV와 EMCV의 복제를 강력하게 억제하는 반면 Lys23Arg/Lys43Arg MDA5는 이미 알려져 있는 바이러스 복제 제한 능력을 상실한 돌연변이인  Ser88Glu MDA5와 같이 바이러스 복제를 억제하지 못한다는 사실을 밝혔다. 이를 통해 MDA5 ISGylation은 바이러스 감염 시 항바이러스 면역을 위해 중요함을 증명하였다. 

참고문헌 

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