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우수논문소개

면역 센서 MDA5 의 ISG15 의존적인 활성과 이를 회피하는 SARS-CoV-2의 분자 기전 규명

  • 작성자

    이정현(독일 울름대학교)
  • 작성일자

    2021-12-15
  • 조회수

    2245

면역 센서 MDA5 의 ISG15 의존적인 활성과 

이를 회피하는 SARS-CoV-2의 분자 기전 규명

ISG15-dependent activation of the sensor MDA5 is antagonized by the SARS-CoV-2 papain-like protease to evade host innate immunity

Nature Microbiology. 6(4):467-478, 2021


 

 

이정현

독일 울름대학교 분자 바이러스학과 프로젝트 리더

jung-hyun.lee@uni-ulm.de 

 

연구 배경

바이러스 감염으로 인한 숙주 면역 시스템의 항상성 교란은 병원체 또는 위험 관련 분자 패턴을 감지하는 선천성 면역 시스템의 수용체에 의해 모니터링 된다1. RIG-I 유사 수용체 (RIG-I-like receptor, RLR)인  RIG-I와 MDA5는 바이러스 또는 바이러스 감염으로 인해 숙주로부터 생성되는 면역 시스템을 활성화하는 RNA 들을 세포질에서 인지하여 바이러스를 감지하는 중요한 역할을 한다. C-말단 도메인 (CTD) 에서의 RNA 결합과 RIG-I 와 MDA5의 헬리카아제 ( helicase)는 그들의 신호 전달 체계를 위한 여러 효소를 단계별로 활성화한다. 이러한 효소들은 RLR의 단백질 수식화 (post-translational modification, PTM)를 사용하여 여러 도메인에서 RLR의 활성을 조절하는데 특히, 신호 모듈인 Caspase activation and recruitment domains (CARDs) 부분에서의 조절이 활발히 연구됐다. 활성화되는 효소 중 하나인 PP1 α/γ는 RIG-I와 MDA5의 CARD 들을 탈인산화한다2.  RIG-I의 경우 탈인산화는 TRIM25 및 기타 E3 ligase에 의한 CARD의 K63- 폴리 유비퀴틴화를 촉진하여 RIG-I의 올리고머 형태를 안정화시켜 MAVS와의 결합을 가능하게 한다3. 그러나 지금까지는 RIG-I와 다르게 MDA5 활성화 단계와 이를 조절하는 PTM에 대해 잘 알려지지 않았다. 기본적으로 RLR 활성화는 유형 I 및 III 인터페론들 (interferons, IFNs)의 생성 후 이를 통해 인터페론 유도형 유전자 (IFN-stimulated genes, ISGs)를 상향 조절하여 항바이러스 신호 체계를 유도한다4,5. 그 중 ISG15는 표적 단백질 lysine 잔기에 ISG15을 공유 결합시킬 수 있는 유비퀴틴 유사 단백질이며, 이 PTM과정을 ISGylation이라 한다. ISG15 결합이 항바이러스성 면역에 기여하는 점은 알려져 있지만6 ISG15의 광범위한 항바이러스 활성을 설명할 수 있는 숙주 단백질 ISGylation의 분자 기작은 현재까지 알려져 있지 않다. 또한, 현재 진행 중인 코로나-19 대유행의 원인 바이러스인 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SCoV2) 는 IFN에 의한 항바이러스 반응을 억제하는 탁월한 능력을 갖추고 있으며, SCoV2에 감염된 환자의 낮은 IFN 생산은 심각한 질병과 연관된다고 알려져 있다7. 코로나바이러스의 IFN 억제 기작을 유도하는 단백질 중에 탈 유비퀴틴과 탈 ISGylation 활성을 갖는 papain-like protease (PLpro) 단백질이 있다8,9. 이에 본 연구진은 바이러스 감염 시 항바이러스 면역을 위해 MDA5 활성을 위한 필수 PTM이 ISGylation임을 밝히고, SCoV2 PLpro가 MDA5에 결합하여 탈 ISGylation 과정을 통해 항바이러스 면역 반응을 회피하는 분자 기작을 규명하여 SCoV2가 MDA5에 의한 면역 감시를 피하기 위해 이미 진화했음을 밝혔다. 

 

연구 결과

1. MDA5활성은 RIG-I와 달리 ISGylation이 필요하며, 2CARD 부분의 lysine 23과 43에서 일어난다.

MDA5활성을 조절하는 PTM을 알아내기 위하여 GST-pull down assay와 액체 크로마토그래피와 결합된 탠덤 질량 분석법 (LC–MS/MS)을 이용한 결과, MDA5 신호 모듈 2CARD 부분에 ISG15가 결합해 있음을 확인하였다 (그림1A). 이 결합이 ISG15의 공유 결합인 ISGylation임을 확인하기 위해 ISG15유전자가 제거된 (knockout, KO) HeLa 세포에 야생형 (Wild type ,WT) ISG15 또는 ISG15 공유 결합에 필요한 두 glycine들을 alanine 잔기들로 대체한 ISG15 돌연변이 (ISG15-AA)를 재구성한 세포를 이용하여 MDA5의 ISGylation을 입증했다 (그림 1B). 또한, MDA5 ISGylation 과정이 MDA5 활성 촉진제인 고분자 (HMV)-poly(I:C)와 댕기 (DENV) 및 지카바이러스 (ZIKV) 감염시에 내생적으로 일어남을 밝혔다 (그림1C). 이러한 ISGylation과정이 정확히 MDA5 2CARD 부분 어느 잔기에서 일어나는지 알아보기 위해 2CARD 부분의 모든lysine들을 arginine으로 개별 대체시켜 실험하였다. 그 결과 23번과 43번 lysine잔기에 ISGylation이 일어남을 관찰하고, 이 두 잔기 모두에 돌연변이 (Lys23Arg/Lys43Arg)를 가지고 있는 MDA5경우  ISGylation이 거의 일어나지 않음을 밝혀 MDA5 2CARD 부분 중 lysine 23과 43잔기가 ISGylation에 필수적임을 증명하였다 (그림1D). 우리는 다음으로 ISGylation과정이 MDA5의 항바이러스성 신호 전달 체계 조절에 중요한지 알아보기 위해 연구를 진행하였다. 우리는 WT 배아 섬유아세포에서 MDA5 발현양에 비례하게 IFN-β​ 생성된 반면 ISG15 유전자가 제거된 세포 (Isg15-/-) 에서는 IFN-β 생성이 제대로 되지 않음을 관찰하였다 (그림1E).  이와는 달리 RIG-I 경우에는 WT 와 Isg15-/- 세포에서 비슷한 양의 IFN-β을 생성하였다. 우리는 다음으로 이미 널리 알려진 MDA5와 RIG-I의 활성을 촉진하는 리간드를 이용하여 내인성 MDA5와 RIG-I의 활성화에 대한 ISG15의 중요도를 평가하였다. MDA5활성 촉진제인 뇌심근염 바이러스 (EMCV) RNA또는 고분자 (HMV)-poly(I:C)의 자극으로 인한 IFN-β​​ 생성은 Isg15-/-세포에 현저히 억제되었지만, RIG-I의 활성 촉진제인 광견병 바이러스의 leader RNA (RABVLe) 발현 또는 센다이 바이러스 (SeV) 감염에 의해서는 차이가 없었다 (그림 1F). 이를 통해 우리는 ISGylation이 RIG-I 와 달리 MDA5의 신호 전달 체계 활성에 필수적이라는 것을 증명하였다. 

 

 

그림 1. Lysine 23과 43의 ISG15 공유 결합을 통한 면역 센서 MDA5 신호 전달 체계 활성화

2. ISGylation은 MDA5 올리고머 형성을 촉진하고 이를 통한MDA5 신호 전달 체계 활성화는 바이러스 복제를 제한한다.

우리는 RLR활성화 과정인 RNA결합, RLR 올리고머화 및 세포질에서 미토콘드리아로의 전위 과정들 중 ISGylation이 MDA5 활성화를 위해 어떤 과정에 기여하는지 알아보기 위한 연구를 진행하였다. 그 결과, WT세포에서 EMC RNA자극이 MDA5 올리고머화를 효과적으로 유도한 반면  Isg15-/-세포에서는 형성되지 않음을 관찰하였다. 또한, lysine 23번과 43번에 돌연변이를 가진 MDA5 (Lys23Arg/Lys43Arg)는 올리고머를 형성하지 못한다는 사실을 통해 ISGylation은 MDA5신호 전달 체계 활성화를 위한 MDA5의 올리고머 형성에 관여한다는 사실을 밝혔다 (그림 2A). 또한 우리는 더 나아가 MDA5 ISGylation이 바이러스 감염 시 이들의 복제를 제한하기 위해 필요한지 연구하였다. 그 결과, WT MDA5는 ZIKV와 EMCV의 복제를 강력하게 억제하는 반면 Lys23Arg/Lys43Arg MDA5는 이미 알려져 있는 바이러스 복제 제한 능력을 상실한 돌연변이인  Ser88Glu MDA5와 같이 바이러스 복제를 억제하지 못한다는 사실을 밝혔다. 이를 통해 MDA5 ISGylation은 바이러스 감염 시 항바이러스 면역을 위해 중요함을 증명하였다. 

 


 그림 2. ISGylation에 의해 촉진되는  MDA5 올리고머 형성과 이를 통한 바이러스 복제 제한


3. SCoV-2 PLpro 는 MDA5와 결합 후 탈ISGylation을 촉진하여 MDA5 의 항바이러스 신호 전달 체계에 대항한다

SCoV와 MERS–CoV 및 SCoV2 등의 코로나바이러스는 자신의 단백질 형성을 위해 비구조 단백질3 (Nonstructural protein 3, NPS3)내에 PLpro효소를 지니고 있다10. 이 PLpro는 탈유비퀴틴화 및 탈ISGylation 활동을 하는 것으로 알려져 있으며, SCoV2 PLpro가 탈ISGylation 활성을 통해 항바이러스 반응을 조절한다는 연구가 최근 발표되었다9. MDA5는 코로나바이러스를 감지하는 주요 센서로 알려져 있고11, 12, 앞서 우리 연구가 밝힌 MDA5에 의한 바이러스 제한에 ISGylation이 필요하다는 것을 근거로 SCoV2 PLpro가 MDA5 ISGylation을 효소 활성을 통해 제거하여 선천성 면역을 회피하느는지를 조사하였다.  PLpro를 포함하고 있는 SCoV2의 NSP3는 MDA5와 직접 결합할 수 있으며, 특히 3D 결정 구조모델은 SCoV2 PLpro가 ISG15와 복합체를 이룬다는 것을 보여준다 (그림 3A). SCoV2 PLpro WT가 효과적으로 MDA5의 ISG15 공유 결합을 제거하는 반면 SCoV2 PLpro 효소 비활성 돌연변이 (PLpro Cys111Ala)9와 ISG15와 결합하는 사이트1 인터페이스에 결함이 생긴 PLpro Asn156Glu an와 PLpro​ Arg166Ser/Glu167Arg는 이러한 탈ISGylation을 유도하지 못했다 (그림 3B). 이와는 대조적으로 유비퀴틴 결합에 중요한 사이트2 인터페이스에 결함이 생긴 PLpro Phe69Ala는 WT PLpro와 같이 MDA5의 탈ISGylation을 촉진했다 (그림 3B). 또한, 우리는 이들 SCoV2 PLpro​ 돌연변이들을 이용해 이 효소의 비활성이 바이러스 감염 후 MDA5에 의한 면역 활성 동안 바이러스 생존에 치명적임을 증명하였다 (그림 3C).





 그림 3. SCoV2 PLpro의 효소 활성을 통한 MDA5의 탈ISGylation을 통한 면역 회피 기작

연구의 성과 및 의의

우리의 연구 결과는 MDA5 ISGylation이 RIG-I Lys63 잔기의 유비퀴틴화와 유사하게 작용함을 보여준다. 두 PTM 모두는 PP1 유도 탈인산화에 의해 조절되고 CARD 올리고머화 및 RLR 올리고머 형성을 촉진한다. 하지만, 유비퀴틴은 감염되지 않은 세포와 감염된 세포 모두에 풍부하지만 ISG15 발현은 바이러스 감염으로 인해 분비되는 IFN에 의해 빠르고 강력히 증가한다. 우리의 연구는 ISGylation에 의한 면역 센서 MDA5 활성이 바이러스 감염시 복제를 제한하는 항바이러스 신호 전달 체계를 위한 중요한 분자 기작임을 밝혔다. 또한, ISG15이 RIG-I를 MDA5와는 반대로 조절하는 것으로 알려져 있으므로13,14 바이러스 감염으로 ISG15 발현이 증가할 때 MDA5 활성화가 촉진되는 반면, RIG-I 활동은 약화되는 '센서 전환'을 유발할 가능성을 제시하였다. 우리는 이번 연구를 통해 SCoV2 PLpro가 선천성 면역 센서 MDA5에 결합한 후 효소 활성을 이용하여 직접적인 탈ISGylation을 통해 MDA5 신호 전달 체계 활성을 차단하여 항바이러스 면역을 회피하는 전략을 가지고 있다는 것을 밝혔다. 그러므로 우리의 연구는 MDA5에 의한 항바이러스성 면역 체계 활성화와 SCoV-2 복제 억제를 위한 ISGylation의 중요한 역할을 밝힘으로써 코로나-19에 대한 치료체를 위한 새로운 방향을 제시할 수 있을 것으로 기대된다. 

 

참고문헌 

1. Wu, J. & Chen, Z. J. Innate immune sensing and signaling of cytosolic nucleic acids. Annu Rev Immunol 32, 461-488, doi:10.1146/annurev-immunol-032713-120156 (2014).

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4. Lazear, H. M., Schoggins, J. W. & Diamond, M. S. Shared and Distinct Functions of Type I and Type III Interferons. Immunity 50, 907-923, doi:10.1016/j.immuni.2019.03.025 (2019).

5. Schoggins, J. W. Interferon-Stimulated Genes: What Do They All Do? Annu Rev Virol 6, 567-584, doi:10.1146/annurev-virology-092818-015756 (2019).

6. Perng, Y. C. & Lenschow, D. J. ISG15 in antiviral immunity and beyond. Nat Rev Microbiol 16, 423-439, doi:10.1038/s41579-018-0020-5 (2018).

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9. Shin, D. et al. Papain-like protease regulates SARS-CoV-2 viral spread and innate immunity. Nature 587, 657-662, doi:10.1038/s41586-020-2601-5 (2020).

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