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PROTAC 및 표적단백질분해 기법 (PROTAC and Targeted Protein Degradation Technology)

  • 작성자

    문성현, 이병훈 (DGIST)
  • 작성일자

    2021-12-15
  • 조회수

    9854

PROTAC 및 표적단백질분해 기법

(PROTAC and Targeted Protein Degradation Technology)

 

  

문성현

대구경북과학기술원 (DGIST) 

뉴바이올로지 전공

t7t7t4t8@dgist.ac.kr 

  

이병훈

대구경북과학기술원 (DGIST) 

뉴바이올로지 전공

byung-hoon_lee@dgist.ac.kr

 

1. 서론

 단백질은 생체를 구성하는 주요 생체분자 중 하나로, 세포 내외의 여러 효소들, 수용체들, 구조물들을 이루면서 실질적인 기능을 수행하는 세포 내의 노동자라고 할 수 있다. 이러한 단백질들은 각각의 기능을 위한 적절한 구조를 가지고 있으며, 생체 내의 여러 반응들을 조절하기 위해 각 단백질들의 활성화/비활성화가 복잡하게 조절되고 있다. 이러한 단백질들의 생성과 소멸 과정에서 이루어지는 단백질항상성 (proteostasis)은 ‘세포 내 단백질 네트워크 체계에서 유지되는 단백질 평형과 이를 통한 최적의 생물학적 기능’이라고 정의할 수 있다. 세포 내의 단백질항상성 유지를 위해서는 단백질 품질 조절 (protein quality control)이 중요하며, 이는 노화, 돌연변이 또는 외부 스트레스로 인해 변성된 단백질의 샤페론 (chaperone)을 통한 단백질접힘 (protein folding) 또는 단백질분해기작 (proteoylsis mechanism)에 의한 병리 단백질의 적절한 제거를 의미한다 [1]. 따라서 세포 내의 성공적인 단백질 품질 조절은 원활한 세포 기능 유지 및 생존을 위해 필수적이다 [2].

 세포 내의 단백질분해는 1) 유비퀴틴-프로테아좀 시스템 (ubiquitin-proteasome system, UPS)과 2) lysosome을 이용하는 오토파지 (autophagy, 자가포식작용)의 두 가지 방법을 통해 이루어진다 [3]. 일반적으로 UPS는 세포 내에서 유비퀴틴이 표지된 특정 타겟단백질의 분해를, autophagy는 불특정 단백질분해, 세포 내 소기관 및 병원체 (pathogen) 분해까지도 담당하는 것으로 알려져 있다. 단백질분해 기전의 조절장애가 일으키는 여러 종류의 암, 퇴행성 뇌질환, 면역질환, 감염병 등의 질병들을 보았을 때, 생체 내에서 단백질항상성을 유지하는 것이 얼마나 중요한 일인지 쉽게 이해할 수 있다 [1, 4-5].

 



 

그림 1. 표적단백질분해 기법 (Targeted Protein Degradation, TDP)의 개요. (A) 2001년 이후 현재까지 PubMed에 발표된 TDP 기법 관련 발표된 논문 수. (B) 최초의 PROTAC 보고로부터 최근까지의 주요 TPD 기법 개발 연표. (C) 전통적 약물과 TPD 약물의 특성 비교표. 

 

최근 이러한 단백질분해 기작을 이용한 새로운 신약개발 기술인 소위 “표적단백질분해기법 (targeted protein degradation, TPD)”이 학계의 큰 관심을 받고 있다 (그림 1A). 표적단백질분해기법은 기존의 전통적인 활성부위지향성 (active site-directed) 약물인 소분자 억제제 (small-molecule inhibitor), 치료 항체 (therapeutic antibody)와는 달리 표적으로 하는 단백질의 직접적인 분해를 유도 (induced proteolysis)하는 방식으로 작용한다. 해당 기법을 통해 특정 암 단백질 (oncoprotein), 단백질 응집체 (protein aggregate) 등의 각종 질병단백질을 효과적으로 제거할 경우, 인간 질병 제어를 위한 새로운 게임체인저로 기능할 수 있을 것으로 기대된다. 이중 현재 가장 활발히 개발이 진행중인 PROTAC (proteolysis targeting chimera)의 경우, 2001년 처음 보고된 이후 비교적 최근인 2015년 경부터 폭발적으로 연구되기 시작한 단백질분해유도 화합물이다 (그림 1A, B). PROTAC으로 대표되는 표적단백질분해기법은 기존의 치료기법들이 지니는 한계를 혁신적으로 극복할 수 있다: 예를 들어, 1) 기존의 약물들은 지속적인 타겟 단백질의 억제를 바탕으로 하는 점유-기반 치료제 (occupancy-driven drug)인 것에 반해 표적단백질분해기법은 타겟 단백질의 비가역적인 분해를 바탕으로 하는 사건-기반 치료제 (event-driven drug)이기 때문에, 훨씬 낮은 농도에서 기능하여 부작용을 최소화할 수 있다. 2) 특정 활성부위에 대한 억제 작용이 필수적이지 않아 현재의 “undruggable”한 단백질들 또한 분해를 통해 타겟팅하는 것이 가능하다 (그림 1C) [6-7].

 현재까지 개발된 대표적인 표적단백질분해기법은 활용되는 단백질분해 기작에 따라 두 종류로 구분할 수 있다. 하나는 PROTAC과 같이 세포에 내재적으로 존재하는 UPS를 하이재킹 (hijacking)하는 기법이고, 최근에는 lysosome 또는 autophagy 과정을 이용하는 LYTAC (lysosome-targeting chimera), AUTAC (autophagy-targeting chimera), ATTEC (autophagy-tethering chimera), AUTOTAC (autophagy-targeting chimera) 등의 기법도 보고되고 있다 [8-9]. 본 글에서는 위 두 종류의 표적단백질분해기법의 원리와 예시들에 대해 소개하고자 한다.

 

2. 본론

2.1. 현재 PROTAC의 개발 현황

 앞서 언급한 것처럼, PROTAC은 세포 내에 내재적으로 존재하는 UPS를 활용하는 (harnessing) 키메라성 분해유도 화합물이다. UPS는 세포 내의 대부분의 단백질분해를 담당하고 있는 주요 경로로서, E1 유비퀴틴 활성화 효소 (ubiquitin activating enzyme), E2 유비퀴틴 결합효소 (ubiquitin conjugating enzyme), 그리고 E3 유비퀴틴 연결효소 (ubiquitin ligase)들의 연속적 반응을 통한 유비퀴틴화 (ubiquitination)와 유비퀴틴화된 단백질기질의 프로테아좀 (proteasome)에 의한 분해과정을 포함한다 [2-3]. E1/E2/E3의 일련의 반응을 통해 기질 (substrate)의 라이신 (lys) 잔기가 유비퀴틴화 되면, 여러 유비퀴틴 수용체 (ubiquitin receptor)들에 의해 26S 프로테아좀에 선택적으로 인식되고, 결과적으로 분해되게 된다. 

PROTAC은 UPS의 구성요소인 E3 (ubiquitin ligase)의 리간드 (ligand)와 표적단백질의 리간드가 linker를 통해 연결된 이종이기능성(heterobifunctional) 화합물로, 삼원구조 복합체 (ternary complex, 즉 E3:PROTAC:POI [protein of interest])를 형성한다. 이를 통해 표적단백질을 E3에 물리적으로 근접시킴으로써 표적단백질의 효과적인 유비퀴틴화와 프로테아좀에 의한 분해를 유도한다 (그림 2) [6,10]. 따라서 적절한 표적단백질 리간드와 E3 리간드를 이용한다면 이론적으로 대부분의 표적단백질에 대해 PROTAC을 개발할 수 있다. 

 

그림 2. PROTAC에 의한 단백질분해유도 기작. (왼쪽) 통상적인 UPS에 의한 단백질분해 기작. (오른쪽) PROTAC에 의한 단백질분해유도 기작. PROTAC을 통한 E3와 표적단백질 간의 물리적 근접에 의해 더 효율적인 유비퀴틴화와 표적단백질분해가 유도됨.

 

최초의 PROTAC은 2001년 Sakamoto, Crews, Deshaies 등의 공동 연구에 의해 보고되었다 [11]. 연구진들은 PROTAC의 새로운 개념 증명을 위해 화합물 ovalicin과 공유결합을 형성하는 것으로 알려진 methionine aminopeptidase-2 (MetAP2)를 타겟으로, 기질선택 기작이 잘 알려진 SCFβ-TRCP를 E3 ligase로 선정하였고, 각각의 리간드로 ovalicin과 β-TRCP 결합 motif인 IκBα의 10개 아미노산 펩타이드 (DRHDSGLDSM)를 선정한 후 linker로 연결하였다. 이렇게 최초로 개발된 PROTAC-1은 표적단백질 MetAP2의 효과적인 유비퀴틴화와 분해를 유도하는 데에 성공하였다. 이후 2004년 von Hippel-Lindau (VHL)를 E3로 사용하는 HIF1α 펩타이드에 기반한 리간드를 사용한 PROTAC, 2008년 MDM2를 E3로 사용하는 첫 번째 소분자 E3 리간드 기반 PROTAC 등이 개발되었으나, μM 수준의 분해효과로 인해 당시에는 큰 주목을 받지 못하였다 [12-13]. 하지만 2015년 VHL의 소분자 E3 리간드, Cereblon (CRBN)의 소분자 E3 리간드를 사용한 PROTAC이 개발되고, 이들이 nM 수준에서도 뛰어난 세포 내 분해효과를 보여줌에 따라 학계의 큰 주목을 받기 시작하였다 [14-16].

현재는 Ras, STAT3, tau, BCR-ABL, AR, ER 등 많은 병리적 단백질들에 대한 PROTAC 개발이 활발히 진행 중인 상황이며, 2019년에 Arvinas사에서 개발한 두 종류의 PROTAC (ARV-110, ARV-471)이 처음으로 임상시험을 시작한 것을 계기로 2021년 올해까지 대략 15개의 PROTAC들 (molecular glue 포함)에 대한 임상시험이 진행 중이거나 진행될 예정이다 [7, 17]. PROTAC 관련 데이터베이스인 PROTAC-DB에 따르면 (http://cadd.zju.edu.cn/protacdb/) 현재까지 대략 2200여개의 PROTAC들과 290여개의 표적단백질들이 등록되었는데, 특허 등의 이유로 등록되지 않은 것들까지 포함하면 이보다 훨씬 더 많은 수가 존재할 것으로 예상된다 [18]. 

더 나아가서, 최근 보다 효율적이고 부작용을 최소화하는 PROTAC 개발을 위해 PROTAC 활성을 시·공간적으로 조절하는 photoswitchable PROTAC (PhotoPROTAC, PHOTAC, Azo-PROTAC), photocaged PROTAC (pc-PROTAC, opto-PROTAC)등의 기법들 또한 개발되고 있다 (그림 3). Photoswitchable PROTAC의 경우, 공통적으로 photoswitchable한 화합물 azo-benzene 그룹을 linker에 추가시킴으로써 특정 파장의 빛에 의해 PROTAC의 활성을 조절한다 [19-21] (그림 3A). Azo-benzene 그룹은 파장에 따라 가역적으로 cis-, trans- 상태로 변화될 수 있으므로, 적절한 파장의 빛을 쏘아줌으로써 PROTAC의 활성을 선택적으로 조절할 수 있다. Photocaged PROTAC의 경우는 photoswitchable PROTAC과는 달리 빛에 의해 비가역적으로 활성화되는 방식 (photocleavable)으로 작용한다 [22-23]. 따라서 활성 이전의 이들은 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl과 같은 cage 그룹으로 각 리간드를 보호하여, PROTAC의 삼원결합 형성을 억제한다 (그림 3B). 이러한 다양한 PROTAC들의 개발을 통해 potency의 향상, 정교한 제어, 임상적 적용가능성 증진의 측면에서 큰 진전을 이루고 있다.


 

그림 3. 시·공간적 활성 조절이 가능한 PROTAC 변형체들의 예시. (A) Photoswitchable PROTAC의 개요. Photoswitchable PROTAC은 공통적으로 azo-benzene구조를 가짐으로써 빛에 의한 가변적 활성 조절이 가능함. (B) Photocaged PROTAC의 개요. Photocaged PROTAC들은 POI 또는 E3 리간드 부위에 photocage가 결합되어 있으며, 특정 파장의 빛에 의해 이 결합이 해제되고 활성화됨.

 

2.2. PROTAC 개발에서 고려해야 할 사항

 PROTAC은 표적단백질 리간드, E3 리간드와 linker로 구성된 키메라성 화합물이므로, PROTAC의 성공적인 개발은 목적에 맞는 E3 ligase 리간드, 표적단백질 리간드, linker의 적절한 조합을 찾아가는 과정이다. 본 챕터에서는 PROTAC 개발과정에서 고려해야할 점과 현재의 한계점 등에 대해 그 구성요소들을 중심으로 논하고자 한다.


2.2.1. E3 ligase / E3 ligase 리간드

 지금까지 대략 ≥600여개의 인간 E3 ligase가 존재한다고 알려졌는데, 그 중에서 VHL, CRBN과 같은 일부 E3를 제외한 다른 많은 E3들에 대해서는 많이 연구되어 있지 않다. 현재 PROTAC 분야에도 VHL과 CRBN E3 ligase의 리간드들이 가장 널리 사용되고 있다. VHL의 경우, 2004년 처음으로 PROTAC 개발에 사용되었으나, 지금과 같은 소분자 기반 리간드는 2012년에 기존의 VHL 기질인 HIF1α와 VHL의 결정구조 분석을 통하여 개발되어 PROTAC에 사용되기 시작하였다 [14,24]. 이후 structure-activity relationship (SAR) 분석을 통해 리간드의 물리적/화학적 성질은 개선하면서도 기존 VHL과의 친화도는 비슷한 리간드들이 성공적으로 개발되었다. CRBN의 경우, 2010년 경부터 이루어진 thalidomide의 drug repositioning에 대한 연구를 통해 CRBN과 thalidomide와의 연관성이 밝혀진 이후 PROTAC의 유망한 E3 ligase 리간드 후보가 되었고, 2015년부터 CRBN을 E3로 사용하는 PROTAC들이 개발되기 시작하였다 [15,16]. 현재에는 thalidomide를 포함한 phthalimide계열 약물 (lenalidomide, pomalidomide 등)들 또한 PROTAC의 리간드로써 널리 사용되고 있다. 위 두 E3 ligase들은 리간드에 대한 연구가 이루어짐에 따라 상대적으로 용이하게 PROTAC에 적용될 수 있었으나, 원칙적으로 새로운 E3 ligase를 사용하기 위한 리간드 개발은 PROTAC 기술 개발에 bottleneck으로 작용한다. 많은 E3 ligase들의 경우 일반적으로 효소반응을 일으키는 활성자리가 없고, 표적단백질 결합자리 또한 다양하기 때문에 전통적인 소분자 억제제로는 제어하기 어려운 undruggable target 중 하나로 여겨지며, 따라서 굉장히 제한된 숫자의 억제제들만 개발되었다. 게다가, PROTAC에 이용하기 위한 E3 리간드는 E3의 원 기능을 훼손하지 않으면서 E3에 결합해야 하므로 일반적인 억제제보다도 개발이 더 어려울 수 있다 [8]. 

 이러한 어려움에도 불구하고 더 많은 E3 ligase 리간드의 개발이 요구되는 이유는, 현재 제한된 종류의 E3 ligase만 이용함으로써 발생하는 PROTAC의 근본적인 한계점들이 존재하기 때문이다. PROTAC의 성공적인 기능을 위해서는 표적단백질, PROTAC, 그리고 E3가 함께 복합체를 형성해야 하는데, PROTAC과 작용하는 세포 내 특정 E3가 발현되지 않거나 발현이 적다면, 다른 대체 E3를 선택하여 PROTAC을 개발해야만이 효율적인 단백질분해를 유도할 수 있을 것이다. 또한, 최근 연구에서 나타난 PROTAC-저항성의 원인으로 E3 ligase 복합체의 일원인 CRL 단백질들이 지목된 바 있기 때문에 [25], E3 ligase 리간드의 pool을 넓히는 것이 가변적이고 효과적인 표적단백질분해를 위해 매우 중요하다고 할 수 있다. 

 실제 최근 연구들은 이러한 문제점을 극복하고자 PROTAC의 E3 ligase 리간드 pool을 다변화시키는 결과를 보여주고 있다. 최근 Nomura 그룹에서 발표한 연구에서는, activity-based protein profiling (ABBP) 기법을 이용해 E3 ligase RNF4에 대한 리간드 CCW-16을 발견하였으며, CCW-16과 BRD4 리간드 JQ1을 연결한 새로운 공유결합기반 PROTAC이 실제로 잘 작동함을 증명하였다 [26]. 이후에도 Keap1의 리간드 bardoxolone, RNF114의 리간드 Nimbolide 등을 이용한 PROTAC들이 개발되어 표적단백질인 BRD4, BCR-ABL의 분해를 nM 수준에서 유도할 수 있음을 보였다 [27-28]. 이러한 결과는 보다 다양한 E3 ligase들이 PROTAC에 의한 표적단백질분해 연구에 사용될 수 있음을 증명한다. 또한, 이후 가용한 E3 ligase pool이 확장됨에 따라 작동위치/장소가 특화된 PROTAC (예: 핵 내의 전사인자-특화 PROTAC) 또는 특정 E3의 특이적 발현을 이용한 질병-특화 PROTAC등을 개발할 기회도 제공한다.


2.2.2. PROTAC Linker

 PROTAC linker는 E3 ligase 리간드 또는 표적단백질 리간드보다 상대적으로 덜 주목받아왔다. 그러나 최근 많은 수의 PROTAC 개발 연구에서 적절한 linker를 사용하는 것이 뛰어난 PROTAC을 개발하는 데에 있어서 매우 중요한 요소임을 보여주는 결과들이 지속적으로 발표되고 있다.

 성공적인 PROTAC을 개발하는 데에 있어서 linker 길이와 이와 연관된 cooperativity (즉, linker, E3 ligase 그리고 표적단백질간의 상호작용)의 두 요소가 중요하다고 여겨지고 있다. 이 중 linker의 길이는 2015년 Crews 그룹의 연구와 2018년 Pfizer 사의 연구에서 그 중요성이 뚜렷하게 나타나고 있다 [29-30]. Crews 그룹은 HaloTag이 결합된 HaloPROTAC에서 다양한 길이의 polyethylene glycol (PEG) linker를 이용해 PROTAC의 분해결과를 확인한 결과, 짧은 linker의 PROTAC에서는 Dmax (최대분해율)가 20%였던 것에 반해, 중간 길이의 linker일때는 95%, 긴 linker에서는 80%의 Dmax를 가짐을 관찰하였다 [29]. Pfizer 사도 비슷한 실험을 진행하여, 다양한 길이의 PEG linker를 사용한 BTK PROTAC에서 적정 길이 미만의 PROTAC들은 모두 효율적인 분해를 보이지 못한 반면, 적정 길이 이상의 PROTAC은 모두 뛰어난 BTK 분해를 보였으며, 그 중에서도 중간 길이의 linker를 가진 PROTAC이 가장 효율적인 분해능력을 보였다 [30]. 더 나아가 저자들은 이러한 분해능력과 ternary complex formation을 time-resolved fluorescence resonance energy transfer (TR-FRET) assay를 통해 추적하여, 실제로 linker의 길이와 ternary complex formation이 밀접한 관계가 있음을 밝혔다. 이를 종합하면, linker의 길이가 일반적으로 적정 ternary complex를 형성할 수 있는 최소 길이 이상일 때, PROTAC이 효과적으로 작동함을 알 수 있다.

 Cooperativity는 ternary complex의 형성 자체라기 보다 PROTAC이 얼마나 오래 안정적인 ternary complex를 유지하는가와 더 관련된 지표라고 볼 수 있다. 이는 binary complex PROTAC:E3 간의 결합에 비해 ternary complex POI:PROTAC:E3 사이의 결합을 비교하여 측정되는 값이며 KDbinary/KDternary = cooperativity α로 정의된다 [31]. 즉, PROTAC에 의한 표적단백질과 E3간의 상호작용이 촉진될 때에는 α>1, 표적단백질과 E3간의 상호작용이 저해되는 경우 α<1로 나타낼 수 있다. 2019년 Ciulli 그룹에서 이러한 cooperativity와 PROTAC-유도 분해능력을 연구한 결과, 동일한 BET 리간드 JQ1을 사용한 두 PROTAC MZ1과 AT1의 cooperativity와 분해능력을 비교하였을 때, MZ1 (α = 22)의 분해효과가 AT1 (α = 4.7)의 그것에 비해 분해 속도와 ternary complex 안정성 측면 모두에서 뛰어남을 확인하였다 [31]. 그러나 cooperativity는 ternary complex의 안정성과 연관되어 있기 때문에, PROTAC의 분해능력과 반드시 일치하는 결과를 보이지는 않는다. 앞서 언급한 Pfizer 사의 BTK PROTAC의 경우, cooperativity는 중간 길이 정도의 linker를 가질 때 최댓값을 보였으나 (α = 2.5) 실제로 효율적인 분해를 유도하는 길이에서는 대략 1 정도의 α값을 보였다 [30]. 이러한 결과는 linker가 길어짐에 따라 가능한 ternary complex의 수 자체는 증가하지만, 그 중 효율적인 유비퀴틴화를 유도할 수 있는 형태의 complex는 제한될 수 있음을 의미한다. 게다가 linker의 구성 요소를 변화시키거나 (예: hydrophobicity의 변화, 극성의 변화 등을 유도), linker와 리간드의 연결 위치를 변경하는 등 구조적인 변화 또한 cooperativity와 분해 능력의 큰 영향을 주는 요소이다.

 따라서 종합하였을 때, 각각의 PROTAC 개발에서 최고의 linker 구조를 예측하는 것은 매우 어려운 일이지만, 매뉴얼한 방식으로 일일이 여러 종류의 linker를 가진 PROTAC을 합성해서 테스트하는 것 또한 매우 비효율적인 일일 것이다. 최근 이러한 PROTAC 개발의 문제를 해결하기 위하여 구조생물학적인 접근방식이 제시되고 있다. Crystal structure를 통한 ternary complex 구조 분석 또는 컴퓨터-기반 모델링을 통한 구조 예측이 최적의 linker 구조를 디자인하는데 큰 도움을 줄 수 있으므로, 차후에는 보다 효율적인 PROTAC 개발이 가능해질 것으로 기대할 수 있다.


2.2.3. 표적단백질 리간드

 전통적인 신약개발 방법들의 문제점 중 하나는 실제로 이 방법을 이용해 FDA 승인을 받은 약물들의 수가 전체 병리적 단백질 중에 극히 일부에만 제한되어 있다는 점이다. Human Protein Atlas에 따르면 전체 인간 단백질 중에서 지금까지 발견된 대략 4,500여개 정도의 질병관련 단백질 중, 오직 ~700개의 단백질들만 FDA 승인된 약물이 존재하며, 나머지 단백질은 애초에 undruggable하거나, 특이성 등의 문제로 인해 개발이 난해한 (예: 일부 kinase들) 질병타겟으로 여겨지고 있다 [32]. 

 PROTAC의 장점은 기존의 undruggable하다고 여겨지던 질병단백질들을 분해를 통해 타겟팅할 수 있을 뿐만 아니라, 기존 억제제들이 가지고 있던 특이성 문제, 약물 저항성 등의 문제 또한 극복할 가능성을 제공한다는 점에 있다. Undruggable하다고 여겨지는 대부분의 단백질들은, 효소 또는 수용체와 같이 저해제가 작용할 수 있는 활성부위를 특정하기 어렵고, 리간드를 개발하여도 억제효과 또는 특이성 문제로 인해 신약 개발로 이루어지지 못할 수 있는데 반해, PROTAC에 사용되는 리간드들은 기존의 소분자 억제제에 비해 이러한 억제효과 또는 특이성 문제로부터 자유로울 수 있다. 

이론적으로, PROTAC의 유비퀴틴화 효과는 안정된 구조의 ternary complex로부터 유도되는 것이고, 표적단백질의 억제가 아닌 분해를 목표로 하기 때문에 표적단백질에 반드시 강하게 결합할 필요는 없다. 실제로 Crews 그룹의 연구에서 리간드의 친화력과 분해능력 간에 절대적 상관관계가 없음을 밝혔다 [33]. 또한, p38의 두 isoform인 p38α, p38δ를 표적으로 하는 PROTAC 개발 연구에서, 동일한 p38 리간드와 VHL 리간드를 사용했음에도 linker의 길이와 VHL에 결합하는 orientation을 변경하는 것만으로도 p38α, p38δ 각각에 특이적인 PROTAC을 개발할 수 있었고 [34], pan-kinase 억제제인 foretinib (133개의 kinase를 억제)을 리간드로 하는 PROTAC의 경우에도 오직 일부 (VHL PROTAC: 9개 kinase들, CRBN PROTAC: 14 kinase들)의 kinase들만 분해되는 것이 관찰되었다 [33]. 따라서 상기 언급한 PROTAC의 구조적 특성으로 인해, 비특이적인 표적단백질 리간드를 사용하더라도 적절한 구조 또는 orientation의 linker를 사용함에 따라 특정 표적에 대해 놀랍도록 뛰어난 특이성을 보일 수도 있다. 

 E3 ligase 리간드의 경우와 마찬가지로 표적단백질에 대한 리간드가 존재하는 경우 PROTAC 개발에 큰 이점으로 작용하기 때문에, 리간드가 알려지지 않은 표적단백질의 경우 이를 극복하기 위해 최근 많은 시도들이 이루어지고 있다. 펩타이드-기반 tau 리간드와 keap1 E3 ligase 리간드를 사용한 tau PROTAC, 가역적/비가역적 공유결합 리간드를 사용한 BTK PROTAC, oligonucleotide를 이용한 두 종류의 transcription factor PROTAC의 개발 (TF-PROTAC & TRAFTAC) 등 새로운 시도들을 통하여 undruggable을 druggable하게 만들기 위한 노력들이 계속되고 있다 [35-38]. 

 

 

2.3. Lysosome 기반 분해유도 기법 – LYTAC, AUTAC, ATTEC and AUTOTAC

 UPS가 대부분의 세포 내 단백질분해를 담당하지만, 세포에는 lysosomal pathway/autophagy와 같이 또 다른 차원에서의 중요한 단백질분해 기전이 존재한다. 전체 인간 단백체의 40%를 차지하는 외세포성 단백질의 분해 또는 세포소기관 등의 분해 기작을 이용하는 표적단백질분해기법은 그런 이유로 등장하였다. 본 챕터에서는 이러한 lysosome 기반 표적단백질분해기법들에 대해 논하고자 한다 (그림 4).


2.3.1. LYTAC

 LYTAC (lysosome-targeting chimera)은 lysosome을 이용한 표적단백질분해기법 중 하나이다. 이 물질은 2019년 Bertozzi 그룹에 의해 개발된 외세포성 단백질의 표적분해 유도화합물로서, 세포내이입 (endocytosis)과정을 하이재킹할 수 있도록 Mannose-6-phospate (M6P)를 리간드로, 수용체로는 cation-independent mannose-6-phosphate receptor (CI-M6PR)를 사용하였다 [39]. CI-M6PR에 인식된 M6P-tagged 단백질은 세포 내에 수용체와 함께 endosome으로 세포내이입되고, 세포 내 lysosome과 융합된 후 분해되게 된다. 연구진들은 M6P-tagged 항체를 사용하여 APOE4, EGFR, PD-L1 등의 다양한 외세포성 단백질의 분해를 유도할 수 있음을 증명하였다. 

최근에는 Spiegel 그룹이 N-acetyl galactosamine (GalNAc) 수용체인 asialoglycoprotein receptor (ASGPR)를 사용하는 molecular degraders of extracellular proteins through the ASGPR (MoDE-A)를 개발하여 생체 내에서 외세포성 단백질 MIF의 분해를 유도하는 것에 성공하였다 [40]. MoDE-A의 경우 앞선 LYTAC과는 달리 표적단백질 타겟팅을 위해 항체가 아닌 소분자 리간드를 사용하고, ASGPR에 결합하는 것으로 알려진 trivalent GalNAc을 ASGPR 리간드로 사용하여, 두 종류의 MoDE-A 화합물로 D-MoDE-A, M-MoDE-A를 개발하였다. 이와 유사하게 최근 ASGPR을 하이재킹하는 LYTAC들 또한 개발되었다 [41-42]. 

 

그림 4. Lysosome 기반 표적단백질분해 유도 기법의 개요. (위쪽 그림) LYTAC, MoDE-A, AbTAC들은 lysosomal degradation 경로를 유도함으로써 표적단백질의 분해를 유도하는 화합물들임. LYTAC의 경우, CI-M6PR 또는 ASGPR 리간드-결합 표적항체를 사용하여 세포내이입 유도. MoDE-A의 경우, ASGPR 리간드와 표적단백질 리간드의 키메라성 화합물을 통해 표적단백질의 세포내이입 유도. AbTAC의 경우, 세포막성 E3 ligase RNF43의 세포 내 유비퀴틴화과정을 통한 세포내이입 유도. 세포내이입된 단백질들은 lysosome과 융합되고 분해되게 됨. (아래 그림) AUTAC, ATTEC, AUTOTAC은 autophagy를 이용한 표적단백질분해 유도 화합물들임. AUTAC의 경우, S-guanylation을 유도하는 FBnG를 리간드로 사용하여 표적을 phagophore로 유도. ATTEC의 경우, LC3와 표적단백질에 동시에 결합하는 소분자화합물을 통하여 phagophore로 유도. AUTOTAC의 경우, LC3-II에 결합하는 p62의 리간드와 표적단백질의 리간드를 연결한 키메라성 화합물을 통하여 phagopore로 유도. Phagopore로 유도된 단백질들은 autophagosome을 형성하고, lysosome과 융합되어 분해되게 됨.​
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또한, 위 방법들과는 달리 세포막성 E3 ligase를 사용한 유비퀴틴화를 통해서 lysosomal pathway를 하이재킹하는 TPD 화합물인 antibody-based PROTAC (AbTAC)도 개발되었다 [43]. 연구진들은 세포막성 E3 ligase 중 하나인 RNF43을 이용하여, RNF43과 표적단백질 PD-L1에 동시에 결합하는 bispecific 항체 AC-1을 개발하고, AC-1에 의한 PD-L1의 endocytosis 유도와 분해가 가능함을 보였다. 이러한 결과들을 종합하였을 때, LYTAC은 외세포성 단백질의 조절과 이와 관련된 질병 치료법 개발을 위한 큰 잠재적 가치가 있을 것으로 기대된다.


2.3.2. AUTAC, ATTEC and AUTOTAC

 2016년 Yoshinori Oshumi 교수는 autophagy에 대한 기작을 밝힌 업적으로 노벨 생리의학상을 수상하였다. Autophagy 또한 세포 내 단백질을 제거할 수 있으며, 기능성이 떨어지거나 오작동하는 세포소기관을 제거하거나 세포 내로 침투하는 병균들에 대한 면역반응 등을 담당한다. 

 Autophagy 기작을 사용하는 표적단백질분해 기법 중 AUTAC의 경우, 세포 내로 박테리아 (예: group A streptococcus 등)가 침입하는 상황에서 일어나는 면역반응인 제노파지 (xenophagy)를 이용하는 기법이다. 박테리아의 세포 내 침입 시, 박테리아 표면에 존재하는 단백질에 8-nitro-cGMP가 붙게되고, S-guanylation 반응이 유도되어 표면단백질에 K63 유비퀴틴화 반응이 일어나며, autophagy가 진행되게 된다. Arimoto 그룹은 8-nitro-cGMP대신 cGMP tagging또한 S-guanylation을 유도할 수 있음을 밝혔고, 이를 바탕으로 cGMP의 signaling 효과를 유도하지 않는 유사체 p-fluorobenzylguanine (FBnG)를 개발하여 autophagy-기반 표적단백질분해를 증명하였다 [44]. 이들은 FBnG와 표적단백질 리간드를 연결한 키메라성 화합물들을 개발하여 MetAP2, BRD4, mitochondria 등의 단백질과 세포소기관의 autophagy를 유도함으로써 분해시킬 수 있음을 증명하였다.

 AUTAC과는 다른 방식이지만, ATTEC 또한 autophagy을 통한 표적단백질의 분해를 유도할 수 있는 화합물이다. 최근 논문에서 연구자들은 mutant huntingtin (mHTT)에 대한 스크리닝 과정에서 mHTT와 LC3에 동시에 특이적으로 결합하는 화합물들인 10O5와 8F20을 발견하여, 이를 바탕으로 소분자 분해유도체 AN1, AN2를 개발하였다 [45]. ATTEC은 autophagy를 하이재킹하는 일종의 molecular glue로 작용하여 mHTT에 대해 특이적으로 결합하고 분해를 유도하였지만, WT HTT는 분해시키지 않는 결과를 보여주었다.

 마지막으로 국내 권용태 교수님 그룹에서도 autophagy-기반 표적단백질분해 화합물을 개발하였다. 연구진은 autophagy 구성요소 중 p62에 주목하여, p62의 ZZ도메인에 결합하는 리간드와 표적단백질 리간드를 PROTAC과 유사한 방식으로 linker를 통해 연결한 AUTOTAC을 개발하였다 [9]. p62는 이후 phagophore 내의 LC3-II와 결합하여 표적단백질을 phagophore 내부로 수송하고, 이후 lysosome과의 융합을 통해 표적단백질이 분해되게 된다. 연구진은 여러 종류의 표적단백질 리간드와 p62 리간드를 조합하여 tau, AR, ER, CRABP2, MetAP2 등의 단백질분해 유도를 확인할 수 있었다. 위와 같은 다양한 연구들은 autophagy-기반 표적단백질분해 유도화합물들 역시 PROTAC 계열 분해유도 화합물만큼의 큰 잠재적 가치가 있음을 보여주는 결과라고 생각된다.



3. 결론

 기존 신약개발기술과의 차별성과 혁신성으로 인해, 표적단백질분해기법은 다음 세대의 게임체인저 후보 중 하나로 꼽히고 있으며, 급속도로 증가하는 표적단백질분해기법 관련 논문의 수, degrader 개발 벤처회사들, 그리고 이들과 협력하는 많은 수의 대형 제약회사들의 모습을 보면, 현재 이 분야에 쏟아지고 있는 학계와 산업계의 폭발적인 관심을 느낄 수 있다. 또한 PROTAC, LYTAC, AUTOTAC과 같은 degrader들 뿐만 아니라, PROTAC의 이종이기능성 화합물의 개념을 다른 효소에 적용한 키메라성 화합물들의 개발 또한 진행되고 있다. 대표적으로 유비퀴틴화된 단백질에서 유비퀴틴을 제거하여 분해를 억제하는 탈유비퀴틴화효소 (deubiquitinase, DUB)와 표적단백질을 결합하는 DUB-TAC이나, 인산화효소를 결합한 인산화유도화합물 (phosphorylation-inducing chimeric small molecule, PHICS) 또는 탈인산화효소를 결합한 탈인산화유도화합물 (dephosphorylation targeting chimera, DEPTAC)과 같은 화합물들의 개발 시도가 그 예시로, 이러한 연구는 키메라성 화합물 개발이 하나의 플랫폼 기술로써 성장할 수 있다는 사실을 시사한다 [46-48]. 현재 진행중인, 그리고 앞으로 진행될 예정인 많은 수의 분해 유도 화합물의 임상시험과 더불어 급속도로 발전하고 있는 응용기술들의 면면은 앞으로 10년 뒤 어떤 결과물들이 배출될지에 대해 무궁무진한 기대를 하도록 만든다.

 

 

4. 참고 문헌

[1] Kaushik, S., Cuervo, A. M. (2015) Proteostasis and Aging. Nat Med. 21, 1406-1415

[2] Goldberg, A. L. (2003) Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature, 426, 895–899.

[3] Ciechanover, A. (2005) Proteolysis: from the lysosome to ubiquitin and the proteasome. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 79-87.

[4] Labbadia, J., Morimoto, R. I. (2015) The biology of Proteostasis in Aging and Disease. Annu. Rev. Biochem. 84. 435–464

[5] Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. (2008) Adapting proteostasis for Disease Intervention. Science, 319, 916-919

[6] Pettersson, M., Crews, C. M. (2019) PROteolysis TArgeting Chimeras (PROTACs) – Past, present and future. Drug Discovery Today: Technologies, 31, 15-27

[7] Sun, X., Gao, H., Yang, Y et al., (2019) PROTACs: great opportunities for academia and industry. Signal Transduction and Targeted Therapy, 4, 64.

[8] Alabi, S. B., Crews, C. M. (2021) Major advances in targeted protein degradation: PROTACs, LYTACs and MADTACs. Journal of Biological Chemistry, 296, 100647

[9] 가니피세티 스리니바스라오, 김희연, 문수란 et al., (2019) 신규한 오토택 키메라 화합물, 이를 포함하는 표적 단백질 분해를 통한 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물. 공개번호 10-2020-0011392

[10] Moon, S., Lee, B. H. (2018) Chemically Induced Cellular Proteolysis: An Emerging Therapeutic Strategy for Undruggable Targets. Mol Cells, 41(11), 933-942

[11] Sakamoto, K. M., Kim, K. B., Kumagai, A et al., (2001) Protacs: Chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation. PNAS, 98(15), 8554-8559

[12] Schneekloth, J. S., Fonseca, F. N., Koldobskiy, M et al., (2004) Chemical genetic control of protein levels: Selective in vivo targeted degradation. J. AM. CHEM. SOC, 126, 3748-3754

[13] Schneekloth, A. R., Pucheault, M., Tae, H. S., Crews, C. M. (2008) Targeted intracellular protein degradation induced by a small molecule: En route to chemical proteomics. Bioorg. Med. Chem. Lett. 18, 5904-5908

[14] Bondeson, D, P., Mares, A., Smith, I. E. D et al., (2015) Catalytic in vivo protein knockdown by small-molecule PROTACs. Nat Chem Biol, 11(8), 611-617

[15] Winter, G, E., Buckley, D, L., Paulk, J et al., (2015) Selective Target Protein Degradation via Pthalimide Conjugation. Science, 348(6241), 1376-1381

[16] Lu, J., Qian, Y., Altieri, M et al., (2015) Hijacking the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon to Efficiently Target BRD4. Chemistry & Biology, 22, 755-763

[17] Mullard, A. (2021) Targeted protein degradation crowd into the clinic. Nat Rev Drug Discovery, 20, 247-250

[18] Weng, G., Shen, C., Cao, D et al., (2021) PROTAC-DB: an online database of PROTACs. Nucleic Acids Research, 49(D1), D1381–D1387

[19] Pfaff, P., Samarashinge, K, T, G., Crews, C, M., Carreira, E, M (2019) Reversible Spatiotemporal Control of Induced Protein Degradation by Bistable PhotoPROTACs. ACS Cent. Sci, 5(10), 1682–1690

[20] Reynders, M., Matsuura, B, S., Berouti, M et al., (2020) PHOTACs enable optical control of protein degradation. Sci. Adv, 6(8)

[21] Jin, Y-H., Lu, M-C., Wang, Y et al (2020)., Azo-PROTAC: Novel Light-Controlled Small-Molecule Tool for Protein Knockdown. J. Med. Chem, 63(9), 4644–4654

[22] Xue, G., Wang, K., Zhou, D., Zhong, H., Pan, Z (2019) Light-Induced Protein Degradation with Photocaged PROTACs. J. Am. Chem. Soc, 141(46), 18370–18374

[23] Liu, J., Chen, H., Ma, L et al (2020) Light-induced control of protein destruction by opto-PROTAC. Sci. Adv, 6(8)

[24] Buckley, D, L., Molle, I, V., Gareiss, P, C et al., (2012) Targeting the von Hippel-Lindau E3 Ubiquitin Ligase Using Small Molecules To Disrupt the VHL/HIF-1a interaction. J. Am. Chem. Soc, 134(10), 4465-4468

[25] Mayor-Ruiz, C., Jaeger, M, G., Bauer, S et al., (2019) Plasticity of the Cullin-RING ligase repertoire shapes sensitivity to ligand-induced protein degradation. Mol. Cell, 75, 849-858.e848

[26] Ward, C, C., Kleinman, J, I., Brittain, S, M et al., (2019) Covalent Ligand Screening Uncovers a RNF4 E3 Ligase Recruiter for Targeted Protein Degradation Applications. ACS Chem. Biol, 14, 2430-2440

[27] Tong, B., Luo, M., Xie, Y et al., (2020) Bardoxolone conjugation enables targeted protein degradation of BRD4. Scientific Reports, 10, 15543

[28] Tong, B., Spradlin, J, N, Novaes, L, F, T et al., (2020) A Nimbolide-Based Kinase Degrader Preferentially Degrades Oncogenic BCR-ABL. ACS Chem. Biol, 15, 1788-1794

[29] Buckley, D, L., Raina, K., Darricarrere, N et al., (2015) HaloPROTACs: Use of Small Molecule PROTACs to Induce Degradation of HaloTag Fusion Proteins. ACS Chem. Biol, 10, 1831−1837

[30] Zorba, A., Nguyen, C., Xu, Y et al., (2018) Delineating the role of cooperativity in the design of potent PROTACs for BTK. PNAS, 115(31), E7285-E7292

[31] Roy, M, J., Winkler, S., Hughes, S, J et al., (2019) SPR-Mediated Dissociation Kinetics of PROTAC Ternary Complexes Influences Target Degradation Rate. ACS Chem. Biol, 14, 361−368

[32] https://www.proteinatlas.org/humanproteome/proteinclasses

[33] Bondeson, D, P., Smith, B, E., Burslem, G, M et al., (2018) Lessons in PROTAC design from selective degradation with a promiscuous warhead. Cell Chem. Biol, 25, 78-87

[34] Smith, B, E., Wang, S, L., Jaime-Figueroa, S et al., (2019) Differential PROTAC substrate specificity dictated by orientation of recruited E3 ligase. Nat Commun, 10, 131 

[35] Lu, M., Liu, T., Jiao, Q et al., (2018) Discovery of a Keap1-dependent peptide PROTAC to knockdown Tauby ubiquitination-proteasome degradation pathway. European Journal of Medicinal Chemistry, 146, 251-259

[36] Gabizon, R., Shraga, A, Gehrtz, P et al., (2020) Efficient Targeted Degradation via Reversible and Irreversible Covalent PROTACs. J. Am. Chem. Soc, 142(27), 11734–11742

[37] Liu, J., Chen, H., Kaniskan, H, U et al., (2021) TF-PROTACs Enable Targeted Degradation of Transcription Factors. J. Am. Chem. Soc, 143, 8902−8910

[38] Samarashinge, K, T, G., Jaime-Figueroa, S., Burgess, M et al., (2021) Targeted degradation of transcription factors by TRAFTACs: TRAnscription Factor TArgeting Chimeras. Cell Chemical biology, 28, 648-661

[39] Banik, S, M., Pedram, K., Wisnovsky, S., Ahn, G., Riley, N, M., Bertozzi, C, R (2020) Lysosome-targeting chimeras for degradation of extracellular proteins. Nature, 584, 291-297

[40] Caianiello, D., Zhang, M., Ray, J et al., (2021) Bifunctional Small Molecules That Mediate the Degradation of Extracellular Proteins. Nat Chem Biol, 17, 947-953 

[41] Ahn, G., Banik, S, M., Miller, C, L., Riley, N, M., Cochran, J, R., Bertozzi, C, R (2021) LYTACs that engage the asialoglycoprotein receptor for targeted protein degradation. Nat Chem Biol, 17, 937-946

[42] Zhou, Y., Teng, P., Montgomery, N, T., Li, X., Tang, W (2021) Development of Triantennary N‑Acetylgalactosamine Conjugates as Degraders for Extracellular Proteins. ACS Cent. Sci, 7 (3), 499–506

[43] Cotton, A, D., Nguyen, D, P., Gramespacher, J, A., Seiple, I, B., Wells, J, A (2021) Development of Antibody-Based PROTACs for the Degradation of the Cell-Surface Immune Checkpoint Protein PD-L1. J. Am. Chem. Soc, 143 (2), 593–598

[44] Takahashi, D., Moriyama, J., Nakamura, T et al., (2019) AUTACs: Cargo-Specific Degraders Using Selective Autophagy. Molecular Cell, 76, 797–810

[45] Li, Z., Zhu, C., Ding, Y., Fei, Y., Lu, B (2019) ATTEC: a potential new approach to target proteinopathies. AUTOPHAGY, 16(1), 185–187

[46] Henning, N, J., Boike, L., Spradlin, J, N et al., (2021) Deubiquitinase-Targeting Chimeras for Targeted Protein Stabilization. doi: https://doi.org/10.1101/2021.04.30.441959

[47] Siriwardena, S, U., Godage, D, N, P., Shoba, V, M et al., (2020) Phosphorylation-Inducing Chimeric Small Molecules. J. Am. Chem. Soc, 142(33), 14052–14057

[48] Zheng, J., Tian, N., Liu, F et al., (2021) A novel dephosphorylation targeting chimera selectively promoting tau removal in tauopathies. Signal Transduction and Targeted Therapy, 6, 269

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