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뇌혈관장벽 모델과 약물전달 전략

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    관리자
  • 작성일자

    2019-04-01
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    5125

뇌혈관장벽 모델과 약물전달 전략


  

 

 

박태은

울산과학기술원 생명과학과

tapark@unist.ac.kr 



1. 서론

 

Blood-brain barrier(BBB)(뇌혈관장벽)은 가장 강력한 생체장벽 중 하나로 뇌를 생체 내 성역으로 만드는 특수한 혈관이다. BBB는 뇌의 항상성을 조절하기 위해 뇌 기능에 필수적으로 작용하는 분자들만을 선택적으로 받아들이고 혈관 투과성이 매우 낮다. 예를 들어 828 g/mol인 트립판 블루를 정맥 내에 주사하면 혈관 내피세포 사이를 통과하여 조직에 분포하게 되지만 중추신경계에서는 나타나지 않는다. 즉 산소와 영양분을 전달하고 이산화탄소와 노폐물을 효과적으로 교환하기 위해 투과성이 높은 타 장기 내 모세혈관들과 차별화된 구조와 기능이 존재한다. 안타깝게도 BBB로 인해 대부분의 중추신경계 약물들은 BBB로 인해 표적 세포까지 전달되지 못하고 좌절되고, 이로 인해 뇌암과 퇴행성 뇌질환 등 우리의 삶의 질을 낮추는 질병들의 치료 효율은 매우 낮은 편이다. 이를 극복하기 위해 약물의 BBB 통과에 대한 생물학적, 화학적 그리고 물리적 관점에서 다양한 방법론이 제시되어 왔음에도 임상에 적용될만한 전략은 부족한 상황이다. 그렇다면 무엇을 더 고려 해야 하는 것일까? 만약 생체 내 BBB의 기능이 구현된 동물모델을 대체할만한 플랫폼이 존재하고, 이를 기반으로 약물 전달과 관련된 연구가 가능하다면 정확하고 신뢰성 있는 연구가 가능하지 않을까? 필자는 이 글을 통해 약물 전달을 연구를 위한 BBB 세포기반 플랫폼에 대해 소개하고, 그 중요성에 대해 소개하고자 한다.


 

2. 본론


2-1. BBB의 구조와 기능


인간 뇌에는 약 1조 개의 모세혈관이 존재하며 겉면적은 약 20m2이다. 해부학적 그리고 기능적으로 주요한 BBB 구성 세포는 혈관 내피세포이지만, 모세혈관 주위를 둘러싼 기저막(basement membrane), astrocyte, pericyte, neuron BBB의 기능을 뒷받침하는 데 중요한 역할을 한다(1). Astrocyte는 뇌에서 가장 풍부한 뇌교세포로서endfeet(종말발)BBB 99% 표면을 덮고 있으며, astrocyte의 수는 BBB의 기능 발현과 유의적인 관련이 있다. Pericyte는 혈관 내피세포와 astrocyte endfeet 사이 기저막에 존재하면서 특히 BBB 내피세포의 폐쇄연접을 향상시킨다. BBB의 기능은 크게 물리적 장벽 및 대사적 장벽 기능으로 구분된다.

 

 1) 물리적 장벽: 뇌혈관 내피세포 사이에tight junction(폐쇄연접)이 존재한다. 이는 세포막 단백질(OccludinClaudin)과세포질 단백질(ZO-1, ZO-2, cingulin, AF-67H6)의 네트워크로 구성되며 세포 내의 미세섬유와 연결되면서 세포 사이의 긴밀한 연결을 형성한다(2). 생체 BBBTEER(Transepithelial electrical resistance) 측정 시 1500-5000 ohm·cm2의 값을 보인다. 세포 뇌혈관을 통해서는 지질성의 물질 혹은 400 Da 이하의 저분자만 세포 사이를 통과할 수 있다. 타 장기의 모세혈관에서 보이는 포음세포도 드물게 존재하여 뇌에서 필요한 대부분의 물질은 transporter carrier와 결합하여 BBB를 통과하게 된다.

 

 2) 대사적 장벽: 뇌혈관 내피세포에는 efflux pump(다제 내출 펌프)가 존재한다. Efflux pump의 종류인 P-glycoprotein(P-gp), MRP1, MRP4, BCRP 단백질은 세포막을 통과한 내피세포 내의 약물들과 결합하여 뇌조직으로 투과되는 현상을 방해한다(3). 특히 소수성 약물들이 주로 efflux pump와 결합함으로써 뇌혈관 내로 다시 빠져나가게 된다(3).


2-2. 인간In vitro BBB 모델


 앞서 언급한 BBB의 생체 장벽 기능을 극복하고, BBB와 밀접한 관련 있는 질병 타깃 약물을 개발하기 위해 다양한 in vitro BBB 모델을 개발해 왔다. 그러나, 어느 in vitro BBB 모델도 생체 내 BBB 기능을 모사하기에는 여전히 부족하다. 이는 사용되는 세포의 기능 발현과 크게 관련이 있다. BBB 기능에서 가장 핵심적인 혈관 내피세포의 경우 대부분 불멸화 세포를(hCMEC/D3, hBMEC, TY10, BB19) 이용하지만, 내피세포 단백질 발현뿐만 아니라 세포 주기도 생체 BBB와 다르기 때문에 모델로서 완벽하지 않다(4). Primary 뇌혈관 내피세포의 경우에도 불멸화 세포의 기능과 크게 다르지 않으며, 낮은 TEER (100 ohm·cm2), 불완전한 tight junction, 낮은 transporter 단백질 발현 등을 보이고 있다(4). 2012년 발표된 Shusta 그룹의 논문에 따르면 인간 역분화 줄기세포를 기능적으로 생체 BBB와 유사한 뇌혈관 내피세포로 분화할 수 있다(5). 신경 전구세포와 내피세포로 공분화(co-differentiation)시키는 과정에서 내피세포는 중추신경계 혈관 형성과 깊은 관계가 있는 Wnt7A/7B 신호전달로 인해 뇌혈관 내피세포의 기능을 갖게 된다. 최적화된 공배양 조건에서 24-48시간 동안 TEER 값은 3500 ohm·cm2를 유지하게 된다(5). 기존에 사용되었던 불멸화 세포 혹은 primary 세포보다 생체 BBB와 유사한 기능을 보이지만 세포의 기능성이 이틀 이상 유지되지 않기 때문에 장시간의 세포 실험을 위해서는 진화된 방법이 요구된다.

 

Static monolayer 모델

 대부분 in vitro BBB 모델은 Transwell을 이용해 구축된다. Transwell의 윗챔버 부분은 혈액면, 아랫챔버 부분은 뇌실질조직을 모방한 것으로서 챔버의 다공성 막으로 인해 위 아래 챔버에서 생성되는 여러 물질들의 교환이 가능하나 세포가 이동하지는 않는다. Monolayer 모델은 Transwell의 윗챔버에 앞서 언급한 인간 뇌혈관 내피세포 배양한 것으로 BBB의 기능 발현에 중요한  astrocytepericyte가 없기 때문에 세포-세포 사이의 커뮤니케이션이 부족하여 BBB의 기능을 제대로 발현하지 못하거나 유지가 어려운 문제가 있다.

 

Static coculture 모델

 뇌혈관 내피세포가 생체와 유사하게 astrocyte pericyte와 공배양되는 조건이다. 윗챔버 다공성막 윗부분에 내피세포가 배양되고, astrocyte 혹은 pericyte는 윗챔버 다공성막 아랫부분 혹은 아랫챔버 부분에 배양될 수 있다. 다양한 연구결과에 따르면 astrocyte는 뇌혈관 내피세포의 tight junction 형성(6), transporter 형성, 세포극성을 유도하며, pericyte는 특히 물리적 장벽을 향상시키는 데 긍정적인 영향을 준다(7). Coculture 모델로서 생체 BBB와 가장 가까운 모델을 만들기 위해서는 내피세포, astrocyte pericyte 삼중 공배양 모델이 제시되었다(8). 대부분의 논문에서는 pericyte를 내피세포와 다공성막을 사이에 두고 접촉하는 공배양 방식을 사용하고, astrocyte는 아랫챔버에 배양되도록 한다. 비록 astrocyte endfeet이 내피세포와 직접적인 접촉을 하지 않지만 화학적으로 소통하면서 내피세포의 기능에 영향을 미치며 이중 공배양에 비해 생체와 더 유사한 기능을 보였다(9).

 

Dynamic in vitro BBB 모델

 생체 내 혈관은 혈액의 유동에 의해 끊임없이 전단응력을 받게 되며 이는 혈관 내피세포의 transporter 발현이나 물리적 장벽 등에 영향을 미친다. 혈관이 받는 전단 응력을 모사함으로써 생체 BBB 기능과 더욱 유사한 모델을 만드는 전략이 제시되었다. 마이크로 다공성의 중공섬유를 이용한 모델의 경우 펌프를 이용해 배지의 유동을 조절함으로써 생체와 유사한 전단 응력을 가할 수가 있다(10). Cucullo의 연구에 의하면 인간 뇌혈관 내피세포를 중공섬유에 배양하고 전단응력을 가하였을 때 TEER 값이 1200 ohm·cm2에 이르는 것으로 밝혀졌으며, 해부학적 구조와 물리적 자극이 생체와 유사하기 때문에 뇌혈관 내피세포 발현 단백질 수준도 크게 향상되었다(11). 그러나 Dynamic in vitro BBB 모델의 가장 큰 단점은 내피세포의 모양을 관찰하기가 어렵다는 점과 일반 공배양 바업에 비해 안정적인 TEER 값을 얻기까지 오랜 배양 시간이 걸린다는 점이 있으며, 이를 보완할 필요가 있다.

 

Microfluidic BBB 모델

 미세유체소자를 이용하여 BBB 미세환경을 구축하는 내용의 연구가 ‘Organ-on-a-chip(생체모방 장기칩)의 중요한 축으로 연구되어오고 있다. 미세유체소자의 디자인에 따라 연구자가 원하는 구조로 BBB 모델을 구축할 수 있으며, 소자 내에 전극을 위치시킴으로써 실시간으로 TEER 값을 재는 것도 가능하다(12). bEND.3 세포와 astrocyte를 미세유체소자에 공배양하고 전단응력을 가한 경우 기존 static 모델에 비해 약 10배 증가한 TEER 값을 보였다(12) (13). 또한 BBB와 뇌 실직 조직 사이의 대사적 연결 관계를 연구하기 위해 BBB-on-a-chipbrain-on-a-chip을 미세 유동적으로 연결한 Neurovascular unit(뇌신경혈관문) 모델도 최근에 제시되었다(14). 앞서 언급한 Dynamic BBB에 비해 microfluidic BBB 모델은 효율적인 약물 전달 연구가 가능할 것으로 보인다. Dynamic in vitro BBB 모델의 경우 내피세포와 주변 세포의 거리가 150 µm만큼의 차이가 나지만 미세유체소자 디자인에 따라 직접 접촉할 수도, 혹은 거리를 최소화할 수도 있다. 또한 디바이스 소재에 따라 광학적 특성이 우수하기 때문에 배양된 세포를 현미경으로 관찰하기도 용이하다.

 

 

2-3. BBB 약물전달을 위한 모델 개발


 인간 BBB 약물 전달 연구를 위한 모델을 개발하기 위해서 염두 해야 할 몇 가지 조건들이 있다. 첫째, 생체와 유사한 물리적 장벽 기능을 보여야 한다. 생체의 BBB TEER 값은 1000-5000으로 알려져 있으며 이는 세포간 물질 이동이 거의 일어나지 않는 환경이다. 새로운 약물의 인체 BBB 통과 효율을 연구하기 위해서는 이보다 낮은 TEER 값으로 인한 세포간 leakage가 최소한으로 되어야 할 것이다. 일례로 인간 BBB 공배양 모델을 이용한 항체 통과 실험에서 BBB 통과 가능하도록 설계된 항체와 그렇지 않은 항체 간에 직접적인 BBB 통과 비교가 불가능하여 pulse-chase 방법으로 정량하는 방법이 제시되었다. 앞서 언급한 iPSC 분화 뇌혈관 내피세포를 이용하는 방식은 이러한 조건을 달성하는 데 도움을 줄 것이다. 둘째, BBB의 대사적 장벽이 생체 수준이어야 한다. 대부분의 약물은 소수성으로 efflux pump와 작용할 가능성이 매우 높다. 다양한 레퍼토리의 efflux pump중 어느 특정 efflux pump 단백질과 상호작용하는지를 규명한다면, efflux pump와의 상호작용을 최소화하는 전략을 고안할 수 있을 것이다. 실험동물과 인간의 efflux pump의 기능과 구성 단백질에는 차이가 있어 인체 내에서 약물과 BBB efflux pump와의 관계를 규명하기가 쉽지 않다(15). 문제는 대부분의 인간 BBB 세포 기반 모델들의 efflux pump가 생체 수준만큼 강력하지 않다는 것이다. 생체에서 뇌혈관이 받는 전단응력을 가하거나, retionic acid와 같은 저분자 물질을 처리하여 efflux pump의 기능을 향상하는 연구가 필요할 것이다(16). 셋째, 모델이 약물 전달 연구에 적절한 디자인이어야 한다. 신뢰성 있고 일관된 BBB 약물 전달 연구를 위해서는 BBB 통과율을 쉽고 빠르게 정량할 수 있는 방법이 필요하며, 예를 들어 혈관 바깥쪽 뇌조직 부분이 하이드로젤로 되어있는 경우 BBB를 통과한 약물을 샘플링하기 어렵기 때문에 부정확한 이미지 프로세싱에 의존할 수밖에 없다. 따라서 목적에 따라 BBB 모델의 디자인에 차이를 두어야 할 것이다. 넷째, 디바이스 소재가 약물과 반응성이 없어야 한다. PDMS(Polydimethylsiloxane)는 높은 산소 투과성 및 생체적합성으로 organ-on-a-chip 디바이스로 널리 이용되고 있으나 높은 logP의 저분자 물질을 흡수하는 성질이 있다(17). BBB 통과에 대한 정확한 정량을 위해서는 PDMS를 대체할 새로운 소재를 찾는 연구가 필요할 것이다.


 

3. 결론


BBB는 여전히 모방하기 어렵고 극복하기 어려운 혈관이다. BBB의 특성과 기능을 모사한 생체 모델을 구축할 수 있으면 기존에 2차원 세포 배양과 종간 차이가 있는 실험동물을 이용하는 데서 오는 오류를 최소화할 수 있을 것이다. 이를 바탕으로 신약의 BBB 투과성을 테스트함으로써 BBB 극복 전략을 마련할 수 있고, 인간 BBB를 표적하는 표적 펩타이드 또는 항체를 스크리닝 함으로써 효율적인 약물 전달 방법을 개발할 수 있다. 또한 이를 확장시켜 질병 환경의 BBB 모델, 혹은 환자 유래의 iPSC를 이용한 BBB 모델을 구축한다면 질병 조건에 특이적으로 약물을 전달하는 전략이나 약물 통과 효율 분석이 정확하게 가능할 것으로 본다. BBB 모델은 국내 연구는 해외의 연구결과에 비해 개발 측면에서 조금 뒤처진 수준이다. 지속적으로 화두가 되고 있는 뇌 연구, 뇌질환 극복 연구의 일환으로 BBB 모델 개발을 위한 노력과 지속적인 연구 지원이 필요할 것이다.


 

4. 참고문헌

 

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2. Hawkins, B. T. and Davis, T. P. (2005) The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease. Pharmacological reviews 57, 173-185.

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4. He, Y., Yao, Y., Tsirka, S. E. and Cao, Y. (2014) Cell-culture models of the blood–brain barrier. Stroke 45, 2514-2526.

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16. Tarapcsak, S., Szaloki, G., Telbisz, A., Gyongy, Z., Matuz, K., Csosz, E., Nagy, P., Holb, I. J., Ruhl, R., Nagy, L., Szabo, G. and Goda, K. (2017) Interactions of retinoids with the ABC transporters P-glycoprotein and Breast Cancer Resistance Protein. Sci Rep 7, 41376.

17. van Meer, B. J., de Vries, H., Firth, K. S. A., van Weerd, J., Tertoolen, L. G. J., Karperien, H. B. J., Jonkheijm, P., Denning, C., AP, I. J. and Mummery, C. L. (2017) Small molecule absorption by PDMS in the context of drug response bioassays. Biochem Biophys Res Commun 482, 323-328.

 


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