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줄기세포 유래 오가노이드의 활용 : 질환 모델링 및 치료제 개발

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    2019-01-01
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    8432
줄기세포 유래 오가노이드의 활용 : 질환 모델링 및 치료제 개발
(Application of Stem Cell-derived Organoids : Disease Modeling & Therapy Development)

 


 

김형식
부산대학교 치의학전문대학원

 

 

1.  서론

 

2015년 낭포성 섬유증으로 고통받던 환자가 최초로 자신의 조직 유래의 오가노이드 기반 약물 스크리닝 테스트를 통해 얻은 정보를 활용하여 치료를 받았다. 이 사례로 인해 오가노이드 기반 기술이 연구에서 실용화로 빠르게 발전하고 있으며 다양한 질환의 모사와 치료법 개발에 오가노이드 플랫폼이 광범위하게 활용되고 있다. 오가노이드란 용어는 단순하게는 장기를 닮은, 즉 장기유사체를 의미한다. 오가노이드는 자가조직화(Self-Organization), 다세포성(Multicellularity), 기능성(Functionality)의 세 가지 특성을 가지고 있어야 한다. 즉, 오가노이드는 생체 내 장기와 유사하게 생체 외에서 3차원 형태로 조직화되어야 하며 장기와 유사한 다양한 세포를 포함하고 있는 동시에 해당 장기의 일부 기능을 재현할 수 있어야 한다.

 

이러한 오가노이드 생산기술의 핵심은 자기재생능(Self-Renewal)과 다분화능(Multipotency)을 보유하고 있는 줄기세포의 배양과 유지 및 분화 유도 기술이며 적절한 조건에서 줄기세포를 배양하면 장기 또는 조직과 유사한 구조의 오가노이드를 생산할 수 있다. 연구자들은 발생단계에서 특정 장기의 생성과 성숙 등을 위한 핵심 신호물질을 발굴하고 이를 생체 외에서 모사함으로써 새로운 오가노이드를 생산하는 방법을 발굴하고 최적화해가고 있다. 오가노이드 생산을 위한 줄기세포는 크게 만능줄기세포와 성체줄기세포의 두 종류로 나눌 수 있다. 배아줄기세포나 유도만능줄기세포와 같은 만능줄기세포의 경우 정밀한 분화 제어를 통해 정확한 조직 형태를 가진 오가노이드로 분화시켜야 하며 성체줄기세포의 경우 특정 장기 내에 존재하는 장기 특이적 줄기세포의 재생기전을 모사한 분화 조건을 활용하여 상대적으로 간단하게 오가노이드를 생산할 수 있다. 

 

현재까지 매우 빠른 속도로 다양한 장기에 대한 오가노이드 제작과 방법이 보고 되고 있다. 장, 간, 폐, 뇌, 신장, 췌장 등을 비롯하여 다양한 오가노이드 제작과 이를 활용한 연구가 전 세계적으로 활발하게 진행되고 있다. 또한, 암 치료 분야에서도 균질한 암 세포주와 불균질한 실제 종양조직 간의 차이점을 개선한 약물 스크리닝 플랫폼으로서 암 오가노이드(Tumoroid)가 활용되고 있다. 이러한 오가노이드는 장기의 발생, 항상성 및 재생기전 연구, 환자유래 오가노이드 뱅킹, 질환 모델링, 약물 개발 및 맞춤형 치료, 조직 재생 등의 다용한 목적으로 활용될 수 있다. 본 리뷰를 통해 현재까지 보고된 오가노이드의 종류와 활용에 대해 살펴보고자 한다.


 

2. 본론

 

2-1. 오가노이드의 종류

 

오가노이드 제작 기술을 활용한 내배엽, 중배엽, 외배엽의 모든 3배엽 유래 장기에 대한 오가노이드 생산이 보고되었으며 가까운 미래에 대부분의 장기 또는 조직에 대한 오가노이드가 확보될 것으로 예상된다 (그림 1). 대표적인 오가노이드의 종류를 각 장기의 유래 배엽에 따라 분류하면 아래와 같다.

 

 

1)  내배엽성 오가노이드


내배엽은 소화기, 호흡기의 상피층과 폐, 간, 담낭, 췌장, 방광 등의 장기를 만들어낸다. 이러한 내배엽 유래의 여러 장기에 대한 오가노이드 제작 방법이 이미 확립되어 있다. 첫 번째로 보고된 오가노이드는 성체줄기세포를 활용하여 제작된 마우스 소장 오가노이드이다. 장에서는 상피층 구성과 유지를 위해 상피세포증식인자(EGF), 윈트 (Wnt) 신호전달물질, 골형성단백질(BMP)의 세 가지의 핵심 인자의 역할이 중요하며 EGF와 Wnt는 움(Crypt) 부위에서 BMP는 융모(Villi) 부위에서 활성을 나타낸다. 이러한 미세환경을 모사하기 위해 Toshiro Sato는 세포외 기질(Matrigel)을 활용하여 성체 상피 줄기세포를 3차원 형태로 배양하면서 Wnt 신호전달 경로의 작용제인 R-spondin 1과 EGF, 그리고 BMP 신호전달 경로의 길항제인 Noggin을 첨가하였다. 이 조건에서 장 줄기세포가 증식하여 장 상피층을 구성하는 모든 세포가 포함된 장과 유사한 구조의 오가노이드를 만들어낼 수 있고 무한대로 증식시킬 수 있음이 확인되었다. 이 기술은 순차적으로 타 장기 또는 조직 오가노이드 생산에도 적용되어 사람의 장, 마우스와 사람의 위, 췌장, 간, 전립샘, 식도, 담낭, 미뢰 등 다양한 오가노이드 제작에 기여하였다.

 

성체줄기세포뿐만 아니라 만능줄기세포로부터 생성된 다양한 내배엽성 오가노이드가 존재한다. 현재까지 보고된 사람 만능줄기세포 유래 오가노이드는 소장, 폐, 간, 갑상샘, 위, 췌관, 담관 등이 있다. 위 오가노이드의 경우 최근에 기존의 장 오가노이드 제작기술을 기반으로 그 배양 기술이 확립되었으며 Kyle McCracken이 마우스의 위는 발생 과정에서 레티노산(Retinoic Acid) 신호전달이 필요함을 규명함으로써 가능해졌다. 즉, 레티노산의 첨가는 만능줄기세포의 분화를 후장(Hindgut)에서 전장(Foregut) 방향으로 유도하였으며 이후 장 오가노이드와 유사한 배양환경에서 위 오가노이드가 생성되었다. 하지만 위 오가노이드의 경우 지속적으로 배양하면서 산을 분비하는 벽세포(Parietal Cell)가 사라지는 점 등은 아직까지 해결해야 할 문제점으로 남아 있다. 최근의 또 다른 오가노이드 기술의 발전 사례로는 만능줄기세포로부터 신경계가 포함된 장 오가노이드 제작에 성공한 보고가 있다. 즉, 유도만능줄기세포 유래의 신경능선(Neural Crest) 세포를 Matrigel 내에 장 오가노이드와 함께 배양하였을 때 신경세포가 장 상피 오가노이드를 둘러싸고 있는 중배엽 층으로 이동하여 생체 내 이식 시 자극에 의해 장 오가노이드의 수축을 유도하는 기능까지 나타낸다는 것이 보고되었다.

 

 

2)  중배엽성 오가노이드

 

중배엽은 간엽, 조혈계, 근육, 연골, 뼈, 신장, 비장, 생식샘, 생식관을 형성한다. 이 중 신장은 굉장히 복잡한 장기 중 하나로 20종류 이상의 분화된 세포로 구성되며 이 세포들의 3차원 배열이 기능적으로 매우 중요하다. 신장의 기본 단위인 네프론(Nephron)의 전구 조직인 요관아(Ureteric Bud)와 후신간엽(Metanephric Mesenchyme)의 경우 두 조직 모두 같은 중배엽(원시선, Primitive Streak)에서 유래하며 만능줄기세포로부터 각각 분화는 가능했으나 동시에 두 조직이 혼재된 오가노이드를 생산하지 못하고 있었다. Melissa Little의 연구실에서 이를 해결할 프로토콜이 보고되었다. 즉, Activin A와 BMP4가 포함된 배양을 통해 만능줄기세포를 원시선으로 유도하고 이후 FGF9 자극을 통해 중간중배엽(Intermediate Mesoderm)으로 유도함으로써 두 가지 조직이 동시에 포함된 신장 오가노이드 생성이 가능하게 되었다. 이후 Wnt와 FGF9 신호전달 제어 시기와 간격을 정밀하게 조절함으로써 현재의 신장 오가노이드 제작 기술이 확립되었다. 또한 다른 중배엽성 오가노이드로서, Notch, Wnt 신호전달 경로 제어를 통해 성체줄기세포 유래의 나팔관 오가노이드 제작이 가능함이 2015년 보고되었다.

 

 

3)  외배엽성 오가노이드

외배엽은 중추신경계, 감각상피, 뇌하수체 등을 포함한 모든 신경조직뿐만 아니라 치아의 에나멜 층, 표피 및 유선, 침샘과 같은 샘조직 등을 형성한다. Yoshiki Sasai 연구실에서는 비부착성 배양접시에서 무혈청 배양 환경으로 배아줄기세포를 배양하여 배상체(Embryoid Body)와 유사한 세포 덩어리를 만들었고 이로부터 특정 배양 조건에 따라 안배(Optic Cup), 소뇌, 해마, 샘뇌하수체 오가노이드를 제작하였다. 뇌 오가노이드의 경우, Madeline Lancaster는 배상체로부터 유도한 신경외배엽을 특정 성장 인자의 첨가 없이 Matrigel에 심었고 이 조건에서 여러 가지 뇌 부위로 분화되는 싹(Bud)이 자라나는 것을 확인하였다. 작은 바이오리액터에서 배양된 이 ‘미니 브레인’은 수 밀리미터에 이르도록 배양이 가능했으며 단일 세포 분석 결과 배아의 뇌와 유사한 성상을 가지고 있는 것이 확인되었다​.

 

 

4)  암 오가노이드

오가노이드 기술은 종양 생검 조직에서 분리된 세포의 3차원 배양을 통해 암 오가노이드(Tumoroid)를 만들고 개인별로 적합한 치료제를 찾기 위한 용도로 활용되고 있다. 이미 결장-직장암, 췌장암, 유방암, 전립선암, 뇌종양, 방광암 등의 종양조직 또는 전이조직 등의 다양한 종양 유형별로 암 오가노이드가 확립되어 있다. 확립된 암 오가노이드는 생체 외에서 무한정 계대배양을 통한 증식 유도가 가능하며 개개인 환자 유래의 다양한 암 오가노이드를 뱅킹하는 단계에 이르러 있다. 이러한 암 오가노이드는 전체 유전체 또는 엑솜 서열 분석 등의 유전체 분석을 통해 오가노이드 종류별로 보존된 변이를 파악하고 치료 타깃을 발굴하는 형태로 활용될 수 있다. 또한 사람 암 오가노이드를 마우스에 이종이식하였을 때 생체 외에서 확인된 약물반응과 유사한 양상이 생체 내에서도 관찰된다는 연구결과가 다수 보고되었다. 이러한 암 오가노이드는 단일 세포로부터 생성이 가능하기 때문에 단일 세포 수준에서 종양의 불균질성, 변이, 전사체 또는 후성유전체, 약물반응 연구 등에도 활용될 수 있다. 최근에는 CRISPR/Cas9 유전자 교정 기술과의 융합을 통해 정상 오가노이드의 특정 종양 관련 유전자에 변이를 일으켜 암 생성 기전을 연구하기 위한 용도로도 활용되고 있다.

 

 

 


그림 1. 오가노이드의 종류 및 제작 기술
Journal of Molecular Medicine (2017) 95: 729-738

 

 

 

2-2. 오가노이드의 활용

오가노이드는 의생명과학 분야의 새롭고 유용한 도구로서 기초에서 응용, 실용화에 이르기까지 다양한 분야에 광범위하게 활용되고 있다. , 장기의 발생단계 또는 항상성 유지 및 재생에서 특정 신호의 역할 규명과 같은 중요한 기초 연구뿐만 아니라 난치질환 모델링과 치료법 개발, 변이가 교정된 오가노이드 이식을 통한 재생 치료 등의 목적으로 활용되고 있다 (그림 2).

 

 

1)  장기의 발생, 항상성 및 재생 연구


오가노이드는 장기의 발생, 성숙, 유지, 재생 기전을 연구하기 위한 ‘최소의 시스템’으로서 기초 연구분야에서의 그 가치가 높다고 할 수 있다. 조직의 자가 재생 기전 등은 주변 조직 및 세포 등에 의한 영향 때문에 생체 내에서 현재까지의 연구기술로는 정확하게 규명하기 어려웠으며 오가노이드를 통해 새로운 핵심 인자들이 규명 또는 검증되고 있다. 예를 들어, 성체줄기세포 유래의 장 오가노이드의 경우 움(Crypt)으로부터 분리한 줄기세포가 상피하 중간엽 세포 또는 조직이 없는 상태에서 완전히 상피층을 다시 만들어 낼 수 있다. 만능줄기세포 유래의 안배 오가노이드의 경우도 표면 외배엽 유래의 신호가 없는 상태에서도 안포가 자동적으로 형태형성 과정을 거쳐 생성됨이 보고되었다.

 

오가노이드의 주요 장점 중 하나는 동물 모델보다 실험적 접근이 훨씬 간편하지만 기존의 2차원 배양 세포보다 장기 또는 조직과 훨씬 유사하다는 점이며 이러한 장점 덕에 장기 생성과 관련된 더욱 깊이 있는 연구결과를 얻을 수 있었다. 특히, 장 오가노이드의 경우 가장 먼저 오가노이드 확립과 연구가 이루어지며 이전에 몰랐던 많은 장 항상성 유지 및 재생과 관련된 핵심 기전이 밝혀졌다. 예를 들어, 마우스의 Lgr5 유전자를 발현하는 장줄기세포가 자기재생이 가능한 콜로니를 형성하는 능력은 줄기세포 주변에 분포하는 파네스 세포(Paneth Cell)에 의한 것임이 보고되었다. 실제로 파네스 세포는 장줄기세포의 유지를 위해 필수 인자인 WNT 리간드를 높은 수준으로 발현하고 있다. 오가노이드를 활용한 연구를 통해 WNT 단백질이 확산을 통해 흩어지는 것이 아니라 파네스 세포로부터 주변 장줄기세포로 전달되며 줄기세포 분화가 진행됨에 따라 딸세포로 희석되어 전달되는 것이 확인되었다. 이러한 연구 결과는 파네스 세포가 장 줄기세포가 존재하는 움(Crypt)에 분포하는 근거를 제시함과 동시에 파네스 세포가 줄기세포의 미세환경(Niche)임을 검증한 사례이다.

 

오가노이드를 활용함으로써 윤리적 문제로 인해 사람 배아 또는 태아 조직을 사용하기 매우 힘든 이유로 그동안 연구가 힘들었던 사람 발생 및 장기 형성 연구가 가능하게 되었다. 또한, 사람 오가노이드와 동물 모델 또는 동물 유래 오가노이드를 비교함으로써 종별 발생의 유사한 점과 차이점을 규명하는 연구가 가능하다. 장 오가노이드 연구를 통해 사람과 마우스 장의 발생학적 기전이 공통적인 부분이 많음이 밝혀진 반면 안배 오가노이드 연구에서는 사람과 마우스의 안배 형성 기간 및 형태형성 기전이 상이함이 보고되었다.

 

 

2)  질환 모델링, 약물 개발 및 맞춤 의학

기존의 단일 세포 배양에 비하여 오가노이드가 가지고 있는 명백한 장점은 바로 장기 또는 조직 수준에서 질환의 모사가 가능하다는 것이다. 즉, 환자의 성체줄기세포 또는 유도만능줄기세포 유래의 오가노이드는 질환의 특정 표현형을 나타내기 때문에 중개연구에 적합한 질환 모델 플랫폼을 제공한다. 따라서 다양한 유전질환, 숙주-병원체 상호작용, 종양 연구를 위한 오가노이드 플랫폼이 이미 개발되었으며 각 질환별로 알려진 병리학적 특징을 나타낸다는 것이 검증되었다. 예를 들어 헬리코박터 파일로리 균을 주입한 사람 위 오가노이드의 경우 세균 감염의 전형적인 증상인 궤양 등이 관찰된다. 이러한 사람 오가노이드 모델은 종간 질환의 진행과 증상이 상이한 경우 더욱 중요한 실험적 도구로 활용될 수 있다. 즉, 헬리코박터 파일로리 균을 마우스에 감염 시키면 사람과 유사한 증상이 관찰되지 않기 때문에 동물 모델을 통한 연구가 어려우며 이러한 질환에서는 현재로서는 거의 유일한 실험 플랫폼이라 할 수 있다.


오가노이드를 활용한 사람의 질환 모델링이 가능해짐으로써 오가노이드는 약물 스크리닝 플랫폼으로 이용되기 시작했다. 예를 들어, 사람 만능줄기세포 유래의 피질 신경 전구세포 또는 오가노이드를 활용하여 지카 바이러스 감염을 치료하기 위한 약물 스크리닝이 진행된 바 있다. 그뿐만 아니라 CFTR 유전자의 변이로 인한 유전 질환인 낭포성섬유증 치료를 위해 오가노이드가 약물 테스트 플랫폼으로 활용된 고무적인 사례가 있다. 환자유래의 CFTR 변이가 존재하는 장 오가노이드를 활용하여 개인 맞춤치료를 시도한 경우로 매우 드문 CFTR 변이가 있어 해당 변이 치료를 위한 알려진 약물이 없는 환자 유래의 장 오가노이드를 활용하여 기존의 낭포성섬유증 약물에 대한 반응을 스크리닝 함으로써 치료 효과를 최적화한 사례이다. 이러한 약물 스크리닝 플랫폼으로서의 오가노이드는 대량 고효율 스크리닝(High Throughput Screening)이 가능한 수준으로 고도화되고 있으며 사람 신장 오가노이드의 경우 자동화된 오가노이드 생성과 약물 효능 분석 시스템이 보고된 바 있다.


오가노이드 바이오뱅크를 통해 개인별, 인종별 유전적 차이를 극복할 수 있는 강력한 스크리닝 플랫폼을 구축하고자 하는 시도가 이루어지고 있다. 예를 들어 낭포성섬유증 환자유래 장 오가노이드 뱅킹을 통해 대부분의 CFTR 변이를 발굴하고 반응성이 높은 약물정보를 확보할 수 있다. 이러한 오가노이드 바이오뱅크는 변이의 수가 훨씬 다양한 종양에 대한 약물 스크리닝을 위해 더욱 필요하다. 첫 번째 암 오가노이드 뱅킹은 사람에서 발병 빈도가 높은 결장암에 대해 시도되었으며 현재는 다양한 암 오가노이드 뱅킹이 진행되고 있으며, 오가노이드를 활용한 생체 외 약물반응과 실제 환자의 임상적 반응을 비교하는 형태로 데이터가 누적되고 있다.


 

3)  재생 의학


오가노이드 기술의 궁극적 목적 중 하나는 이식 가능한 조직 또는 기능성 세포 치료제의 원천으로서 활용하는 것이다. 동물 모델에서는 이미 이러한 개념이 검증된 사례가 있다. 안배 오가노이드 제작프로토콜을 활용해 만든 마우스의 배아 또는 유도만증줄기세포 유래 망막세포 시트를 마우스 망막변성 모델에 이식하여 광 반응성이 회복되는 것을 보고한 실험 사례가 있으며 마우스 결장 오가노이드를 이식하여 점막 손상을 재생한 사례도 있다. 이러한 동물모델에서의 이식 성공 사례는 간, 신장 오가노이드의 경우도 보고되었다. 오가노이드는 이식하고자 하는 세포뿐만 아니라 미세환경 역할을 하는 다른 세포가 같이 존재하며 안정적인 구조를 가지고 있다는 점에서 단일 세포 치료법에 비해 높은 이식 효율을 보이는 것으로 여겨지고 있다.

 

재생의학적 목적의 오가노이드 활용은 생체 외 유전자 교정기술과 융합함으로써 극대화될 수 있다. 한 사례로, 낭포성섬유증의 가장 보편적인 CFTR 변이를 가진 환자 유래의 장 오가노이드를 CRISPR/Cas9을 이용하여 유전자 교정을 하였을 때 정상 기능을 하는 오가노이드로 교정될 수 있음이 보고되었다. 비록 아직까지는 오가노이드의 재생의학적 적용은 초기 단계의 분야이지만 오가노이드 이식 또는 유전자 교정의 안전성과 모니터링 기술의 개선에 따라 활용 가능한 기술로서 발전할 수 있을 것으로 기대된다.

 

 


그림 2. 오가노이드의 활용 분야 
Nature Reviews Genetics (2018) 19: 671-687

 

 

3.  결론

 

오가노이드의 제작과 활용 기술은 매우 빠른 속도로 발전하고 있으나 한계점이 다수 존재한다. 아직까지 모든 종류의 오가노이드가 특정 장기 또는 조직의 모든 세포를 포함하고 있지는 않으며, 배양과정 중에 특정 세포가 사라지는 등의 해결 방법을 찾지 못한 사례도 존재한다. 또한 대부분의 질환은 특정 장기 자체의 세포뿐만 아니라 근육세포, 혈관세포, 신경세포, 면역세포, 미생물총 등과의 상호작용을 통한 병인 기전이 포함되기 때문에 보다 유사한 질환 모델링을 위해서는 모든 미세환경이 포함된 오가노이드의 성숙화 기술 개발이 필요하다. 재생의학적 분야에서는 대부분의 오가노이드 제작이 암세포 유래 세포외 기질성분으로 구성된 Matrigel에 의존하고 있다는 점과 아직까지 오가노이드의 크기 자체가 이식 수준에 미치지 못한다는 점 또한 문제점이다. 이러한 한계점을 극복하기 위해 오가노이드의 크기와 수명을 증가시키고 결여된 세포 또는 조직을 포함시키고 미세환경과 자가조직화를 제어하기 위한 다양한 접근법이 제시되고 있으며 이러한 다양한 융복합적 접근법을 통해 질환 모델링과 치료제 개발 및 재생의학 분야에서 오가노이드의 활용도는 점점 높아질 것으로 기대된다 (그림 3).

 

 

그림 3. 오가노이드의 한계점 극복을 위한 접근법 
Nature Reviews Genetics (2018) 19: 671-687

 

 

 

4. 참고문헌

 

1.  Rossi, Giuliana et al. (2018) Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics 19, 671-687.

2.  Dutta, Dnevanjali et al. (2017) Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends in Molecular Medicine 23, 393-410.

3.  Bartfeld, Sina et al. (2017) Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. Journal of Molecular Medicine 95, 729-738.

4.  Artegiani, Benedetta et al. (2018) Use and application of 3D-organoid technology. Human Molecular Genetics 27, R99-107.

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