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Laboratory of Proteome Homeostasis​

  • 작성자

    관리자
  • 작성일자

    2019-01-01
  • 조회수

    781

Laboratory of Proteome Homeostasis

 

 

오세경


가톨릭관동대학교 의학과, 국제성모병원 뇌과학중개연구소

 

 

 

 

[연구실 소개]

 

2018년 개실한 본 연구실은 가톨릭관동대학교 의학과 및 국제성모병원 뇌과학중개연구소에 소속되어 있으며, 실험실 세팅을 한창 진행하고 있다. 본 연구실의 연구 목적은 단백질체의 항상성이 정상 세포에서 어떻게 유지되며, 암, 퇴행성 뇌질환, 심혈관계 질환 등에서 어떻게 변형되는지 규명하는 데에 있다. Ribosome에서 일어나는 다양한 단백질 합성 및 단백질 Quality Control 메커니즘, 세포 스트레스 상황에서 유도되는 Stress Granule 등의 과립형 RNA-단백질 복합체 등, 본 연구실은 단백질체 항상성에 미치는 영향을 RNA 대사 조절의 측면에서 분석하고 있다. 이를 위해 iCLIP-seq, Ribosome Profiling 등의 각종 RNA Sequencing 기술, Proximity Labeling을 이용한 Proteomics 기술 등, 최신 연구 기법을 활용하고 있다. 그뿐만 아니라 유도만능줄기세포(induced Pluripotent Stem Cells; iPSCs)를 이용한 Disease Modeling 및 CRISPR-Cas9을 이용한 정밀 유전체 조작도 필요시 연구에 적용하고 있다.

 

 

 

[연구 내용]

 

 

1.  암세포에서 흔히 발견되는 DDX3X 유전자 변이

본 연구실은 DEAD-box RNA Helicases 중 하나인 DDX3가 조절하는 단백질체 항상성 조절 메커니즘을 집중적으로 연구하여 왔다. 최근 다수의 암 유전체 연구들을 통해 DDX3를 암호화하는 DDX3X 유전자가 여러 종류의 암에서 매우 높은 빈도로 반복적으로 돌연변이 됨이 분명해졌다. 어린아이의 소뇌(Cerebellum)에 주로 발병하는 Medulloblastoma(MB)의 경우를 보면, DDX3X의 유전자 변이들의 대다수는 Missense Mutation이며 DDX3의 효소 활성에 관련된 도메인에 집중되어 있다 (그림 1A). 이는 Medulloblastoma에서 발견되는 변이 DDX3 단백질의 효소 활성이 정상 DDX3에 비해 저하되어 있음을 시사한다. 본 연구실은 순수 분리한 DDX3 단백질의 효소 활성을 측정하여 Medulloblastoma와 관련된 DDX3 변이 단백질들은 ATP 가수분해 능력 및 이에 의한 RNA 이중나선 Unwinding Activity가 Wild-type DDX3에 비해 실제로 저하되어 있음을 확인하였다 (그림 1B).

 

 

 


그림 1. Medulloblastoma에서 발견되는 DDX3 변이들의 생화학적 특성

(A) Medulloblastoma에서 DDX3X 유전자의 돌연변이에 의해 생성되는 DDX3 단백질 변이들.

(B) 순수 분리한 DDX3 단백질의 효소 활성 측정. R276K, R276Y, R534H는 Medulloblastoma와 연관된 변이 DDX3 단백질들.




2.  RNA HelicaseDDX3에 결합하는 단백질 및 RNA의 특성

이러한 DDX3의 저하된 효소 활성이 어떻게 암세포의 진화, 생존 및 증식에 기여하는지는 아직 그 이해가 충분하지 못하다. 그뿐만 아니라 DDX3에 대한 기초적인 생화학, 분자생물학적인 이해도 부족한 실정이어서 DDX3가 다른 단백질들과 어떻게 상호작용하는지, RNA Helicase로서 어떤 RNA와 결합하는지를 먼저 밝힐 필요가 있었다. 본 연구실은 DDX3 결합 단백질체를 Native Condition으로 세포에서 분리하여 그 단백질 구성을 LC-MS/MS 기법으로 조사하였다. 그 결과 Wild-type DDX3 및 대표적인 Medulloblastoma 변이 단백질인 DDX3R534H가 공통적으로 Splicing 및 Ribosome 관련 단백질들과 매우 밀접하게 상호작용함을 알게 되었다 (그림 2A).


이어서, 본 연구실은 RNA Helicase인 DDX3가 결합하는 RNA를 RNA Sequencing의 일종인 iCLIP-seq을 수행하여 Global Transcriptome-level에서 DDX3와 결합하는 RNA의 구성 및 그 결합 양상을 밝혔다. DDX3는 Guanine-rich Sequences를 통해 Messenger RNA(mRNA)와 가장 많이 상호작용하며 (그림 2B), 특이하게도 mRNA의 5’ Untranslated Region(5’ UTR) (그림 2C), 그중에서도 특히 AUG Translation Start Codon(TIS, Translation Initiation Site) 근방에 집중적으로 결합한다 (그림 2D). 또한 DDX3는 mRNA 이외에 Ribosomal RNA(rRNA)와도 많은 결합을 이루는데 이 결합들은 Ribosome Small Subunit과 Large Subunit의 Docking에 중요한 18S rRNA의 특정 지역에 집중되어 있다 (그림 2E).


이상의 결과들은 DDX3가 단백질 합성 과정, 특히 Translation Initiation 스텝에 깊숙이 관여함을 시사한다. iCLIP-seq 실험에서 Medulloblastoma 변이 단백질인 DDX3R534H는 Wild-type에 비해 타깃 RNA 결합이 Global Transcriptome Level에서 전반적으로 낮음을 확인하였고, 이는 암세포에서 단백질 합성 능력이 Medulloblastoma 변이 DDX3 단백질에 의해 저하될 수 있음을 시사한다.



 


 

그림 2. DDX3와 결합하는 단백질 및 RNA

(A) DDX3와 결합하는 단백질, 대체로 ribosome 및 spliceosome 요소들이 다수를 차지. (B) DDX3와 결합하는 RNA 종류의 구성. RT stop은 RNA에 mapping된 DDX3 결합 염기(nucleotide)를 지칭. (C-D) DDX3가 mRNA에서 결합하는 지역. (E) DDX3가 rRNA와 결합하는 지역 (화살표, 녹색).




3.   DDX3에 의한 단백질 합성 조절 

DDX3에 의한 단백질 합성을 좀 더 직접적으로 측정하기 위해 최신의 RNA Sequencing의 일종인 Ribosome Profiling을 수행하여, Ribosome에서 번역(Translation)되고 있는 mRNA의 글로벌한 양상을 조사하였다. 예상한 대로 Medulloblastoma 변이 단백질인 DDX3R534H​를 발현하는 세포는 정상 세포에 비해 단백질 합성(Ribosome engagement)이 저하되었다. 그런데 놀랍게도 세포 스트레스 상황에서는 정반대의 상황이 관찰되었다. 일반적으로 스트레스 상황에서는 Stress Granule 등의 과립형 RNA-단백질 복합체 형성을 통해 단백질 합성이 극도로 저하된다 (그림 3). DDX3는 Stress Granule 형성에 깊이 관여한다고 알려져 있었는데, 실제로 Wild-type DDX3의 발현은 세포 스트레스 상황에서 단백질 합성 저하를 촉진하였다 (그림 3). 그런데 Medulloblastoma 변이 단백질 DDX3R534H​를 발현하는 세포는 스트레스에 의한 단백질 합성 저하가 충분히 일어나지 않고, 오히려 Chromatin Assembly 및 Nucleosome Organization에 관련된 일련의 mRNA Translation은 지속되었다 (그림 3). 결론적으로 본 연구실의 최근 연구 결과들은 Medulloblastoma 변이 DDX3 단백질들이 세포 스트레스 상황에서 특정 단백질 합성을 계속 유지시킴을 밝혔으며, 암세포가 겪는 스트레스에서 이들 DDX3 변이들이 Genome Protection에 기여할 수 있음을 시사한다.

 

 


 

그림 3. DDX3가 조절하는 스트레스 상황에서의 단백질 합성 양상

스트레스 상황에서 일반적으로 단백질 합성이 저하되나, Medulloblastoma 관련 DDX3 변이(DDX3R534H​)의 발현은 Chromatin Assembly 및 Nucleosome Organization에 관여하는 단백질의 발현을 유지시킨다.




4.  본 연구실에서 진행 중인 연구

단백질체 항상성은 단백질 합성과 단백질 분해라는 크게 두 개의 방향에서 유지된다. 위에서 기술한 바와 같이 본 연구실의 최근 연구는 DDX3가 매개하는 단백질 합성의 역할을 규명하였고, 이를 이어서 현재는 DDX3가 단백질 분해 과정에도 연결되어 있는지 연구하고 있다. 실제로, 본 연구실은 암에서 발견되는 DDX3 변이를 발현하는 세포가 대표적인 단백질 분해 메커니즘인 Ubiquitination을 촉진시킴을 관찰하였다. Ubiquitination 혹은 De-Ubiquitination에 관련된 각종 Factor들이 DDX3와 상호 작용하는 패턴을 조사하는 등, 본 연구실은 DDX3가 단백질 분해 과정에 관여하는 메커니즘을 밝히는 연구를 진행하고 있다.

 

이상의 기초적 분자생물학 생화학 연구를 암 환자 치료법 연구에 Translation 하기 위해 인하대학교 병원 류정선 교수님 연구실과도 긴밀한 공동연구를 시작하였다. 류교수님 연구실은 폐암 환자 샘플을 대단위로 확보하고 이를 이용한 유전체, 전사체 분석을 다수 진행하고 있다. 본 연구실은 이 귀중한 재료를 활용하여 DDX3 등 RNA Metabolism에 관련된 요소들이 환자 Population Level에서 어떤 식으로 작동하는지 연구하고 있다. 이를 통해 단백질체 항상성의 측면에서 암의 발병 및 진행 메커니즘을 규명하고 새로운 치료법을 마련할 수 있으리라 기대한다.



 

[연구 책임자]

 


 

오세경 교수

 

주소: 인천시 부평구 동수로 56, 인천성모병원 의생명융합연구관 313

전화: 032-280-6525

Email: ohskjhmi@ish.ac.kr

 

 

 

[대표논문]

 

1.  Kwon S.H., Oh S., Nacke M., Mostov K.E., Lipschutz J.H. (2016) Adaptor protein CD2AP and L-type lectin LMAN2 regulate exosome cargo protein trafficking through the Golgi complex. J biol chem 291(49), 25462–75.

2.  Oh S., Flynn R.A., Floor S.N., Purzner J., Martin L., Do B.T., Schubert S., Vaka D., Morrissy S., Li Y., Kool M., Hovestadt V., Jones D.T., Northcott P.A., Risch T., Warnatz H.J., Yaspo M.L., Adams C.M., Leib R.D., Breese M., Marra M.A., Malkin D., Lichter P., Doudna J.A., Pfister S.M., Taylor M.D., Chang H.Y., Cho Y.J. (2016) Medulloblastoma-associated DDX3 variant selectively alters the translational response to stress. Oncotarget 7(19), 28169–82.

3.  Oh S., Kato M., Zhang C., Guo Y., Beachy P.A. (2015) A comparison of Ci/Gli activity as regulated by Sufu in Drosophila and mammalian Hedgehog response. PLoS ONE 10(8), e0135804.

4.  Tang Y., Gholamin S., Schubert S., Willardson M.I., Lee A., Bandopadhayay P., Bergthold G., Masoud S., Nguyen B., Vue N., Balansay B., Yu F., Oh S., Woo P., Chen S., Ponnuswami A., Monje M., Atwood S.X., Whitson R.J., Mitra S., Cheshier S.H., Qi J., Beroukhim R., Tang J.Y., Wechsler-Reya R., Oro A.E., Link B.A., Bradner J.E., Cho Y.J. (2014) Epigenetic targeting of Hedgehog pathway transcriptional output through BET bromodomain inhibition. Nature medicine 20(7), 732–40.