그림 2. 단백질 응집을 일으키는 두 가지 경로. 위는 통상적으로 이전부터 받아들여져 온 결정핵 생성 후 응집 (nucleation-aggregation) 경로이며 아래는 액체로부터 고체로의 상 전이 (liquid-to-solid phase transition) 경로임
스트레스 과립의 소멸을 매개하는 것으로 잘 밝혀진 VCP는 ATP 의존적 펼침 효소(unfoldase)로 유비퀴틴화 수식이 진행된 단백질을 기질로 가지는 육량체 형태의 복합체이다 (5). VCP는 프로테아좀과 자가포식작용을 통한 단백질 제거 혹은 탈유비퀴틴화 효소를 이용한 기질의 재활용 등에 모두 기능함으로써 단백질 항상성 유지에 기여하는데 이는 스트레스 과립의 소멸에서도 마찬가지이다. 특히 ALS-FTD-IBM의 발병 연관 VCP 변이는 자가포식작용을 통한 스트레스 과립의 제거(clearance)에 영향을 미치는 것으로 보고되었으나 어떤 상황에서 스트레스 과립 프로테옴의 해체 후 재활용 또는 프로테아좀과 자가포식작용 등을 통한 제거로 표적되는지에 대한 연구는 부재한 상황이었다 (6). 한편, VCP 이외에도 UBQLN2, p62, OPTN 등 유비퀴틴화 수식 의존적 세포 경로에 연관되어 있는 다른 유전자들이 스트레스 과립의 유동성과 가역성을 조절하는 기능을 하며 ALS-FTD-IBM 발병의 원인이 되는 유전 변이가 분포하는 것으로 밝혀진 바 있다 (4). 이는 세포에 주어지는 스트레스 종류에 따라 유비퀴틴화 수식화 단백질의 프로테옴, 이른바 유비퀴티놈의 프로파일이 달라진다는 보고에서의 결과와 일맥상통하는데 특히 열충격 스트레스를 받은 세포의 유비퀴티놈의 상당수가 스트레스 과립에 분포하며 유비퀴틴화 수식 경로를 불활성화하는 E1 유비퀴틴 활성화 효소의 저해제를 통해 스트레스 과립의 소멸이 늦춰진다 (7).
연구결과
1. 열충격 스트레스 특이적으로 발생하는 스트레스 과립 코어 단백질 G3BP1의 유비퀴틴화 변형
내생적 단백질의 다중 유비퀴틴화 수식을 측정할 수 있는 TUBE 침강 실험을 통하여 G3BP1 단백질이 열충격 스트레스 상황에서 유비퀴틴화 됨을 확인하였다. 반면 비소 또는 삼투 스트레스에 의해서는 G3BP1의 유비퀴틴화가 이루어지지 않았다. 열충격에 의한 G3BP1의 다중 유비퀴틴화 변형의 사슬 형태를 유비퀴틴 단백질의 몇 가지 돌연변이체를 이용하여 확인한 결과 유비퀴틴의 63번째 Lysine 위치로 연결되는 사슬 형태 (Lys-63-linked chain)가 관여함을 알 수 있었다. 또한 면역세포염색을 통해 열충격을 통해 형성된 스트레스 과립 내에서의 유비퀴틴 사슬을 탐지한 결과 G3BP1 야생형이 발현되는 세포에서는 Lys-63-linked chain이 발견되는데 비해 유비퀴틴화 변형이 이루어지지 않는 G3BP1의 돌연변이가 발현되는 세포에서는 해당 chain이 상당 부분 감소함을 확인하였다 (그림 3).
그림 3. 스트레스 과립에 존재하는 Lys-63-linked 다중 유비퀴틴 사슬
2. 열충격 상황에서 형성된 스트레스 과립의 해체(disassembly)에 기여하는 G3BP1 NTF2L 도메인에서의 유비퀴틴화 변형
프로테옴 분석 문헌 결과를 토대로 G3BP1의 유비퀴틴화 변형이 가능한 것으로 보이는 라이신 위치를 검토한 결과 총 10개의 라이신이 NTF2L 도메인과 RRM 도메인에 각각 6개와 4개씩 분포함을 알 수 있었다. 이를 기반으로 각각의 도메인에 위치한 라이신을 모두 아르기닌으로 치환한 돌연변이(NTF2L 6KR, RRM 4KR) 형태의 G3BP1을 제작한 후 열충격받은 세포로부터 면역침강된 G3BP1의 유비퀴틴화 여부를 NTF2L 도메인이 대부분의 유비퀴틴화 변형이 이루어지는 위치임을 밝혔다. 유비퀴틴화 사슬에서 확인되는 이중 글라이신 모티프를 탐지한 질량 분석을 통해 마찬가지로 NTF2L 도메인에 위치한 50번째 라이신이 열충격에 의하여 유비퀴틴화 수식됨을 확인하였다.
G3BP1/2 녹아웃 U2OS 세포를 모세포로 삼고 G3BP1 야생형과 유비퀴틴화 불능 NTF2L 6KR 돌연변이에 GFP가 접합된 리포터를 발현하도록 하는 세포주를 제작한 후 열충격 받은 세포에서의 G3BP1의 유비퀴틴화 변형이 스트레스 과립의 가역성에 영향을 미치는지 확인하고자 하였다. 유비퀴틴화 불능 NTF2L 6KR 형태의 G3BP1을 토대로 만들어진 스트레스 과립의 경우 야생형에 비해 1시간 열충격을 주어 생성된 스트레스 과립이 다시 해체되는데 더 오랜 시간이 필요함을 밝혀냈다 (그림 4). 이와 결부되어 유비퀴틴화 불능 NTF2L 6KR 형태의 G3BP1로 구성된 과립이 해체되는 상황에서 유동성이 감소되어 있음을 광표백 후 형광 복구 기법으로 알아낼 수 있었다. 즉, 스트레스 과립의 물질적 특성이 열충격에 의한 G3BP1의 유비퀴틴화 수식과 연관이 있음으로 결론지을 수 있다.
그림 4. 유비퀴틴 불능 NTFL 6KR G3BP1으로 형성된 스트레스 과립에서 보이는 가역성의 감소
3. 열충격 상황에서 이루어지는 G3BP1과 VCP간의 상호결합
연구 배경에서 설명하였듯 VCP는 스트레스 과립의 소멸에 필수적인 역할을 하는 것으로 보고되었다. 본 연구 결과 열충격 스트레스를 받은 U2OS세포에서 내성적 G3BP1과 VCP 단백질간 상호결합이 증대됨을 면역 침강으로 확인하였다. 위의 열충격 의존적 상호작용은 유비퀴틴화 불능 NTF2L 6KR의 변이 G3BP1에서는 이루어지지 않았으며 열충격 상황에서 형성된 스트레스 과립으로의 VCP 단백질 이동 역시 유비퀴틴화 불능 G3BP1 NTF2L 6KR을 발현하는 세포에서는 나타나지 않았다. 즉, VCP이 스트레스 과립의 소멸 및 가역성 보존의 기능을 수행하기 위해서는 G3BP1의 유비퀴틴화가 선행되어야 함을 알 수 있다.
4. 단기/중기 스트레스에서 생성되어 해체되는 스트레스 과립과 VCP의 연관성
스트레스 과립의 소멸 (elimination) 경로로는 크게 해체 (disassembly) 경로와 자가포식에 의한 제거 (clearance) 경로로 나뉜다. 스트레스 과립의 형성을 일으키는 스트레스의 강도 혹은 주어진 시간 등에 의해 소멸 경로가 결정될 것이라는 가설을 세운 후 G3BP1-GFP 리포터 세포주를 이용하여 가역성을 확인하였다. Bafilomycin A1을 처리하여 자가포식이 억제된 G3BP1-GFP 발현 세포에 각기 다른 길이(30분, 60분, 90분)의 열충격 스트레스가 주어 자가포식 경로에 대한 의존성의 차이를 보이는지 확인하였다. 그 결과 90분의 열충격이 주어진 경우에만 스트레스 과립의 소멸이 저해되는 것을 확인하였다 (그림 5).
아울러 60분의 열충격 상황에서 VCP siRNA를 통한 양적 조절, VCP의 활성 억제 약물 처리 등이 이루어진 경우 스트레스 과립이 해체가 지연되는 것을 확인하였다. 광활성화 기법으로 시각화된 G3BP1에 대한 펄스 추적 (pulse-chase) 실험을 통해서도 스트레스 과립으로부터 G3BP1 이탈에 VCP가 관여됨을 알 수 있었다.
이와 함께 자가포식 경로를 통한 스트레스 과립 제거의 불완전성을 초래하는 것으로 알려진 ALS-FTD-IBM 연관 VCP 돌연변이인 R155H와 A232E가 스트레스 과립의 해체 역시 늦추는 것을 확인할 수 있었다 (6).
그림 5. 장기 스트레스를 통해 형성된 스트레스 과립의 제거에 기여하는 자가포식 작용
5. VCP를 통한 스트레스 과립 해체 과정에서 소포체에서 기능하는 보조인자 FAF2
VCP에 유비퀴틴화된 기질을 연결하여 주는 보조인자 중 스트레스 과립 프로테옴에서 발견되는 7개의 유전자 중 FAF2만이 유일하게 G3BP1과의 상호결합이 열충격 상황에서 증대되었으며 RNAi를 통한 발현 억제로 스트레스 과립의 해체가 지체되었다.
FAF2는 기존에 소포체에 존재하는 단백질로 알려져 있으며 스트레스 과립이 해체되는 상황에서 소포체와 접하게 된다는 사실이 최근 보고되었다 (9, 10). 이를 토대로 FAF2가 소포체에서 VCP-G3BP1 복합체와 만나면서 스트레스 과립을 해체를 촉진한다는 가설을 면역형광기법으로 검증하였고, 소포체-FAF2-VCP-G3BP1이 ER에서 서로 만나며 FAF2의 녹다운에 의하여 이 연결이 저해됨을 확인하였다 (그림 6).
그림 6. 스트레스 과립과 소포체를 연결하는 FAF2
연구의 성과 및 의의
스트레스 과립의 소멸되는 기작이 스트레스의 종류와 지속 기간에 따라 달라질 수 있다는 점에서 밝혀 내었으며 이는 퇴행성 신경질환 발병을 이해하는데 중요할 수 있다. 가역성 저하로 인해 세포 내에 잔존하는 스트레스 과립은 만성적인 스트레스 자극 혹은 질환 연관 유전 변이를 통해서 많아지며 이는 자가포식 작용을 통하여 제거될 수 있다. 반면 보편적인 스트레스 과립은 해체 경로를 통해 재활용 혹은 프로테아좀을 통한 일부 제거 등을 거쳐 소멸될 수 있다. 이 과정 중 LLPS의 역과정에 해당하는 탈응축 (decondensation)이 일어날 수 있으며 개별적인 구성 단백질이 스트레스 과립으로부터 빠져나오고 전령리보핵산도 다시 번역될 수 있을 것이다.
열충격에서만 나타나는 G3BP1의 다중유비퀴틴화, VCP 보조인자로의 FAF2의 참여 등을 밝힘으로써 스트레스 과립의 상황 특이적 해체 기전의 분자적 이해를 높일 수 있었다 (그림 7). 추후에는 다른 스트레스 상황에서 스트레스 과립의 해체 혹은 소멸에 기여하는 인자들을 발굴하는 과제가 남아 있는 상태이다.
또한 스트레스 과립의 해체에서 소포체가 기여하는데 FAF2가 참여한다는 것을 밝힌 것은 막성 세포소기관과 무막성 스트레스 과립간 상호작용을 설명할 수 있다는 점에서 큰 의의가 있다. 스트레스 과립 등 생체분자 응축물은 개별 분자 수준이 아니라 분자 네트워크 수준으로 작동하므로 이것을 조절하는 것은 일련된 기능적 단위를 조작할 수 있다는 점에서 큰 장점이 있다. 향후 FAF2처럼 막성 소기관과 무막성 응축물 사이를 연결해주는 유전 인자 발굴은 큰 의의를 가질 수 있을 것이다.
그림 7. G3BP1 다중 유비퀴틴화 변형으로 촉진되는 열충격 생성 스트레스 과립의 해체 기작
참고문헌
1. Glauninger H, Wong Hickernell CJ, Bard JAM, Drummond DA. (2022). Stressful steps: Progress and challenges in understanding stress-induced mRNA condensation and accumulation in stress granules. Mol Cell S1097-2765(22)00481-6 .
2. Mathieu C, Pappu RV, Taylor JP. (2020). Beyond aggregation: Pathological phase transitions
in neurodegenerative disease. Science 370, 56-60.
3. Yang P, Mathieu C, Kolaitis RM, Zhang P, Messing J, Yurtsever U, Yang Z, Wu J, Li Y, Pan Q, Yu J, Martin EW, Mittag T, Kim HJ, Taylor JP. (2008). G3BP1 Is a Tunable Switch that Triggers Phase Separation to Assemble Stress Granules. Cell 181, 325-345.e28.
4. Alberti S, Hyman AA. (2021). Biomolecular condensates at the nexus of cellular stress, protein aggregation disease and ageing. Nat Rev Mol Cell BiolImmunol 22, 196-213.
5. van den Boom J, Meyer H. (2018). VCP/p97-Mediated Unfolding as a Principle in Protein Homeostasis and Signaling. Mol Cell 69, 182-194.
6. Buchan JR, Kolaitis RM, Taylor JP, Parker R. (2013). Eukaryotic stress granules are cleared by autophagy and Cdc48/VCP function. Cell 153, 1461-1474.
7. Maxwell BA, Gwon Y, Mishra A, Peng J, Nakamura H, Zhang K, Kim HJ, Taylor JP. (2021). Ubiquitination is essential for recovery of cellular activities after heat shock. Science 372(6549), eabc3593.
