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우수논문소개

호중구 세포외덫 형성 저해 및 CXCR2의 감소를 통한 포스포리파제 D2의 패혈증 병리에서의 기능 규명

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    2016-04-01
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    755

호중구 세포외덫 형성 저해 및 CXCR2의 감소를 통한 포스포리파제 D2의 패혈증 병리에서의 기능 규명

Phospholipase D2 drives mortality in sepsis by inhibiting neutrophil extracellular trap formation and down-regulating CXCR2. JEM 212: 1381-1390, 2015.

 

 

 

           
이성균                   ​      배외식
gyoon1202@skku.edu       yoesik@skku.edu
성균관대학교 자연과학대학 생명과학과



연구배경

  패혈증은 미생물의 감염으로 유발되는 전신성 감염성 염증반응이며 미국에서 27% 사망률을 차지하는 질병으로 패혈증에 효과적인 치료제가 전무한 상태다 (1). 패혈증에 의한 사망은 숙주의 내재면역반응의 기능장애 또는 감염된 병원균의 효과적인 제거가 이뤄지지 못함으로써 면역세포의 활동과잉으로 인한 과잉면역반응을 초래하게 되어 숙주의 사망을 유도한다 (2).

  호중구는 병원균의 감염시에 가장 먼저 감염부위로 이동해 오는 백혈구 세포로서 감염균을 제거하는 일차 기능을 담당한다 (3). 감염부위로의 호중구 이동은 대표적인 호중구 이동성 조절 수용체인 CXCR2에 의하여 조절됨이 알려져 있으며, 패혈증 환자에서 호중구의 CXCR2 수용체 발현이 많이 감소함이 밝혀졌다 (4). 최근 호중구의 살균기능 중 호중구 세포외덫(Neutrophil Extracellular Traps, NET)에 의해 순환하는 병원균을 NET을 이용하여 얽어 놓은 후 다양한 과립인자에 의해 살균작용을 수행됨이 알려졌다 (5).

 포스포리파제 D2(Phospholipase D2, PLD2)는 호중구 및 여러 다른 세포에서 중요한 세포 신호전달 효소로 알려졌으며 세포막에 존재하는 포스파티딜콜린을 가수분해하여 포스파티딕산과 콜린을 생성한다. 포스파티딕산은 세포이동, 증식 그리고 성장을 조절하며 다양한 인산화 효소 및 탈인산화 효소의 결합 및 활성을 조절하는 것으로 알려져 있다 (6).

  그러나 병원균에 의해 유도된 패혈증에서의 PLD2의 기능적 역할에 대해서 연구되어진 바가 없기에 본 연구진은 다양한 실험적 패혈증 모델을 이용하여 PLD2의 기능적 역할에 따라 호중구의 세포활성 조절에 대해서 연구하였다.




연구결과

 

1. 패혈증 유도에 의한 생존율 및 다양한 장기 기능 저하에서의 PLD2의 기능

  패혈증 동물 모델에서의 PLD2의 역할을 확인하기 위해 맹장 결찰과 천자(Cecal Ligation and Puncture(CLP))방법과 패혈증을 유발하는 대표적인 그람 양성균인 Staphylococcus aureus 주입을 통한 생존율을 관찰하였다. PLD2 결핍쥐에서 CLP Staphylococcus aureus 감염에 의한 생존율 감소가 현저히 저해됨을 관찰하였다. PLD2는 효소활성에 의한 면역반응을 조절하며, 이는 PLD2 저해제인 PLD2 Inhibitor에 의해 효소활성이 저해됨이 알려졌다. CLP에 의한 사망률 또한 PLD2 저해제에 의해 완화됨을 확인하였다. 패혈증에 의한 사망은 폐, 간등의 주요 장기의 손상 및 기능장애와 상관성이 높음이 알려져 있다. CLP에 의한 패혈증 진행중 폐포의 구조 파괴, 혈전의 증가로 인한 폐의 기능 상실이 유도되지만 PLD2 결핍 쥐에서는 정상 쥐와 유사할 정도로 폐 손상이 저해됨을 확인하였다. 또한 패혈증 동물모델 에서 심각한 간 손상이 증가하며 간 손상의 생물지표로 알려진 Aspartate Transaminase(AST) 역시 증가함을 관찰하였다. 반면 패혈증이 유도된 PLD2 결핍 쥐에서의 손상은 매우 완화됨을 확인하였다. 결과적으로 PLD2 결핍에 의한 패혈증 치료효과가 증가됨을 확인하였다.





그림 1. PLD2 CLP에 의한 패혈증에서의 사망률 증가에 필요하다. Wild Type 또는 PLD2 결핍 쥐에서의 패혈증 모델을 확립 (a), 또는 S. aureus 주입 (b), 피하지방으로의 PLD2 Inhibitor 또는 Vehicle Control 주입 후 패혈증 모델을 확립하여 (c) 10일간의 생존율을 관찰하였다. CLP 24시간 때 폐와 간을 적출하여 H&E Staining(핵 및 세포질 염색)을 통하여 관찰하였다 (d, f).  폐는 wet/dry 비율을 측정하여 수치화하였다 (e). 혈장에서의 AST 수치를 측정하여 수치화 하였다 (g). (출처: Lee et al., JEM 212: 1381-1390, 2015.)


2. 패혈증 유도에 의한 염증성 사이토카인 분비와 면역세포 사멸에서의 PLD2 기능


​  패혈증 초기, 다양한 염증 세포의 과도한 염증반응 중 대표적인 것은 염증성 사이토카인 분비에 의함을 들 수 있다. 염증성 사이토카인의 분비에 의한 면역세포 사멸이 유도되며 결국 조직의 기능 저하에 의한 장기의 손상과 같은 일련의 과정이 패혈증 발병 동안 진행된다. 이에 본 연구에서는 패혈증 진행 동안 증가되는 염증성 사이토카인의 분비에서 PLD2 역할을 확인하였다. CLP 의한 패혈증 모델에서 다양한 염증성 사이토카인의 분비가 증가하지만 PLD2 의 결핍 쥐에서 감소함을 확인하였다. 또한 패혈증에 의해 증가된 염증성 사이토카인을 PLD2 저해제 처리에 의해 감소함을 역시 확인하였다.

  염증성 사이토카인 분비는 결국 다양한 면역세포 사멸을 유도한다. 이를 확인하기 위해 비장, 흉선, 신장 그리고 간에서의 면역세포사멸을 TUNEL Assay기법으로 확인하였다. 패혈증 유도에 의한 면역세포 사멸의 수는 Wild Type 쥐에서 크게 증가하지만 PLD2 결핍된 쥐에서 크게 줄어듦을 확인하였다.




 
그림 2. PLD2는 패혈증 유도에 의한 염증성 사이토카인의 분비를 증가시키며 이로 인한 면역세포사멸을 유도한다. 패혈증 유도된 Wild Type PLD2 결핍 쥐에서의 복강 세척액 및 비장, 흉선, 신장, 간을 추출하였다 (a-c). 복강 세척액을 통하여 사이토카인을 측정하였다 (a). 비장, 흉선, 신장, 간에서 면역세포 사멸을 관찰하기 위해 TUNEL Assay기법을 이용하였다 (b, c). (출처: Lee et al., JEM 212: 1381-1390, 2015.)


3. 살균작용 및 NET 형성에서의 PLD2역할

  ​CLP 패혈증 모델에서 많은 수의 박테리아가 복강에서 방출되며 방출된 박테리아를 제거하기 위해 가장 먼저 호중구가 감염부위로 이동해 오게 된다. 패혈증 진행 동안 많은 수의 병원균이 복강, 혈액, 기관지 등 다양한 장기로 이동하여 감염을 유발한다. 그러나 PLD2의 결핍 쥐에서는 다양한 감염부위에서의 병원균을 감소시킴으로써 살균작용이 크게 증가됨을 확인하였다. 호중구는 NET을 이용하여 병원균을 포획한 후 과립인자에 의해 살균작용을 수행한다. 또한 NET의 표지인자는 Peptidylarginine Deiminase(PAD) 효소작용에 의한 히스톤 3 시트르린화(Histone 3 Citrullination) 이다 (7). 놀랍게도 패혈증 모델에서의 PLD2 결핍쥐는 Wild Type 쥐에 비해 히스톤 3 시트르린화가 더 증가됨이 복강 및 폐에서 확인되었으며 이는 PAD 효소활성을 증가시킴에 따른다는 것을 관찰하였다 .이러한 일련의 작용에 의해 PLD2 결핍 호중구는 살균작용을 증진함을 알았다.



 

 그림 3. 패혈증 유도된 PLD2 결핍 쥐는 살균작용 및 NET 형성을 증가시킨다. (a-e) 패혈증 유도된 Wild Type PLD2 결핍 쥐에서의 복강 세척액, 혈액, 기관지 세척액, , 비장, 폐를 추출하여 Blood Agar Plate에서의 집락형성단위(CFUs)를 확인하였다 (a). 복강에서의 호중구(Ly6G+) 수를 확인하였다 (b). 복강에서의 히스톤 3 시트르린화를 확인하였다 (c). 폐에서의 호중구 및 히스톤 3 시트르린화를 공초점 현미경을 통하여 확인하였다 (d). 폐에서의 PAD 활성을 확인하였다 (e). (출처: Lee et al., JEM 212: 1381-1390, 2015.)

 

 

 

4. CXCR2조절에 의한 호중구 이동성에서의 PLD2 역할


​  PLD2 결핍 쥐에서 패혈증 발병 후 감염부위로의 많은 수의 호중구가 이동해 오며 세균 집락형성단위가 줄어듦을 확인하였다. CXCR2는 감염부위로의 호중구 이동성에 매우 중요한 세포표면 수용체로 알려졌으며 패혈증 환자에서는 크게 감소되어 있음이 알려졌다. 이에 PLD2 결핍 호중구에서 CXCR2 수용체 발현여부를 확인하였다.

 

  PLD2 결핍쥐에서 기관지로의 호중구 이동이 증가됨을 확인하였으며, 세포표면에서의 CXCR2 수용체 발현이 증가됨을 확인하였다. CXCR2 수용체 발현과 관련된 신호전달 체계에서 G-Protein Coupled Receptor Kinase 2(GRK2) 활성은 매우 중요하다. Lipopolysaccharide(LPS)에 자극에 의해 GRK2 활성이 증가되며 결과적으로 세포표면에 존재하는 CXCR2의 내제화가 증가된다. LPS자극에 의해 증가되는 GRK2 발현이 NF-κB 신호전달 경로를 통해서 매개되며, PLD2 결핍 호중구에서는 GRK2 발현이 현저히 감소됨을 확인하였다.  그렇다면 패혈증 치료효과를 나타내는 PLD2 결핍 쥐에 CXCR2 길항물질을 처리할 경우 PLD2에 의한 치료효과를 저해하는지 실험하였다. 결과적으로 PLD2 결핍에 의한 패혈증 치료효과가 CXCR2 길항물질처리에 의해 저해됨을 확인하였다.



  

 

 

 

그림 4. 패혈증 과정에서 PLD2CXCR2를 감소시킴으로써 호중구 이동을 저해한다. (a, b) 패혈증이 유도된 Wild Type PLD2 결핍 쥐에서의 기관지 세척액을 얻어 전체 백혈구 및 호중구를 유동 세포 분석법을 통하여 확인하였다 (a). (c-f) Wild Type PLD2 결핍 쥐에서의 분리한 호중구를 LPS로 자극을 준 후 표면에 존재하는 CXCR2 수용체를 유동 세포 분석법을 통하여 확인하였다 (b, c). SB203580, FR180204, SP600125, SC-514 또는 BAY11-7082 처리 후 GRK2 발현 수치를 특수 단백질 검출 검사법을 이용하여 확인하였다 (d, e). 세포질의 p65와 핵에서의 p65발현 양상을 특수 단백질 검출 검사법을 이용하여 확인하였다 (f). 패혈증 모델 만들기 2시간전 CXCR2 길항제 SB225002 또는 Vehicle 주입 후 생존율을 10일간 관찰하였다 (g). (출처: Lee et al., JEM 212: 1381-1390, 2015.)

 

 

5. PLD2결핍 호중구의 중요한 역할을 통한 패혈증 치료효과를 확인


  패혈증 유도에 의한 사망률 및 과도한 면역반응은 PLD2 결핍에 의해 감소함을 확인하였다. 그렇다면 PLD2가 결핍된 호중구에 의한 패혈증 치료효과인지 확인하기 위해 Anti-Ly6G Antibody를 이용하여 호중구 제거 후 Wild Type쥐의 호중구와 PLD2 결핍 쥐의 호중구를 각각 Wild Type쥐에 면역세포를 이입하여 패혈증 모델을 유도하였다. PLD2 결핍 호중구가 이입된 Wild Type쥐에서 살균작용이 더 높았으며 폐 감염 및 면역세포의 사멸이 높게 감소되었음을 확인하였다. 또한 흥미롭게도 PLD2 결핍 호중구는 Wild Type 호중구보다 더 많은 수의 호중구가 감염부위로 이동함을 확인하였다. 결과적으로 PLD2 결핍에 의한 패혈증 치료효과는 호중구의 세균작용 및 이동성의 증가에 의한 것임을 증명하였다.




 

그림 5. PLD2 결핍 호중구 이입에 의한 패혈증 치료효과를 높인다. (a-f) Wild Type쥐의 호중구와 PLD2 결핍 쥐의 호중구를 분리 후 각각 Wild Type쥐에 호중구를 이입하여 패혈증 모델을 유도하였다. 복강 세척액을 추출하여 Blood Agar Plate에서의 집락형성단위(CFUs)를 확인하였다 (a). 폐와 비장을 추출하여 H&E Staining(핵 및 세포질 염색)을 통하여 관찰하였다 (b). 면역세포 사멸을 관찰하기 위해 TUNEL Assay기법을 이용하였다 (c). 복강 세척액을 통하여 사이토카인을 측정하였다 (d). 각각의 호중구에 CFSE 표시 후 기관지 세척액에서 CFSE표시 세포를 유동 세포 분석법을 통하여 확인하였다 (e). Wild Type쥐의 호중구와 PLD2 결핍 쥐의 호중구를 분리 후 각각 Wild Type쥐에 양자면역세포를 이입하여 패혈증 모델을 유도 후 생존율을 10일간 관찰하였다 (f). (출처: Lee et al., JEM 212: 1381-1390, 2015.)

 

 

 

연구의 성과 및 의의


  미국에서만 연간 약 80만명의 환자가 발생하며, 사망률이 약 27%에 달할 정도로 심각한감염질환인 패혈증을 효과적으로 치료할 수 있는 치료제 개발을 위해서는 패혈증 병리에 대한 연구가 필요한 실정이다. 본 연구는 패혈증 동물 모델을 이용하여 PLD2가 패혈증 병리 조절에서 중요하게 작용하고 있음을 규명하였다. 패혈증은 다양한 감염균의 감염에 의해 유발되는 전신성 염증반응으로 감염균을 제거하기 위해서는 다양한 종류의 면역세포들의 효과적인 활성화가 필수적이다. 본 연구에서는 패혈증 동물모델에서 PLD2가 호중구가 병원균을 효과적으로 제거하는 데 중요한 기전인 NET 형성을 저해함으로써 호중구에 의한 살균작용을 저해하여 궁극적으로 개체가 사망하게 되는데 기여함을 규명하였다. 이러한 PLD2에 의한 NET 형성 저해에 관련된 작용기전으로 PLD2 PAD 활성 저해를 통해서 히스톤 시트리린화를 저해할 수 있음을 확인하였다. 아울러, 감염균의 침입에 의해 균의 내독소의 일종인 LPS에 의해서 호중구 이동에서 핵심기능을 담당하는 CXCR2가 감소되는 과정을 PLD2가 매개함을 규명하였다. 한편, PLD2에 의한 LPS-유도 CXCR2 감소에 관련된 분자기전으로 NF-κB 활성화와 이를 통한 GRK2의 활성기전을 규명하였다. 본 연구결과는 아직까지 효과적인 치료제 개발이 전혀 이뤄지고 있지 않는 패혈증에 대한 치료제 개발에 PLD2가 중요한 표적분자가 될 수 있음을 규명한 것으로 중요한 의의가 있다.




참고문헌



1. Angus, D.C., Linde-Zwirble, W.T., Lidicker, J., Clermont, G., Carcillo, J., and Pinsky, M.R. (2001) Epidemiology of severe

    sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care. Crit. Care Med. 29, 13031310.

2. Hotchkiss, R.S., Monneret, G. and Payen, D. (2013) Sepsis-induced immunosuppression:from cellular dysfunctions to

    immunotherapy. Nat. Rev. mmunol. 13, 862874.

3. Alves-Filho, J.C., Sonego, F., Souto, F.O., Freitas, A., Verri Jr., W.A., Auxiliadora-Martins, M., Basile-Filho, A., McKenzie, A.N.,

    Xu, D., Cunha, F.Q. and Liew, F.Y. (2010) Interleukin-33 attenuates sepsis by enhancing neutrophil influx to the site of

    infection. Nat. Med.16, 708712.

4. Cummings, C.J., Martin, T.R., Frevert, C.W., Quan, J.M., Wong, V.A., Mongovin, S.M., Hagen, T.R., Steinberg, K.P. and

    Goodman, R.B. (1999) Expression and function of the chemokine receptors CXCR1 and CXCR2 in sepsis. J. Immunol. 162,

    23412346.

5. Brinkmann, V., Reichard, U., Goosmann, C., Fauler, B., Uhlemann, Y., Weiss, D.S., Weinrauch, Y. and Zychlinsky, A. (2004)

    Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science 303, 15321535.

6. Jang, J.H., Lee, C.S., Hwang, D. and Ryu, S.H. (2012) Understanding of the roles of phospholipase D and phosphatidic acid

    through their binding partners. Prog. Lipid Res. 51, 7181.

7. Wang, Y., Li, M., Stadler, S., Correll, S., Li, P., Wang, D., Hayama, R., Leonelli, L., Han, H., Grigoryev, S.A. et al. (2009)

    Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J. Cell Biol. 184, 205

    213.


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