생화학분자생물학회

후성유전 조절자 억제는 테모졸로마이드 항암제 내성을 극복하고 교모세포종 종양 재발을 억제한다

Epigenetic modulator inhibition overcomes temozolomide chemoresistance and antagonizes tumor recurrence of glioblastoma 

Journal of Clinical Investigation 130(11):5782-5799, 2020

전남대학교 생명산업공학과, 교수 

(E-mail: bsmoon@jnu.ac.kr)

연구배경

Glioblastoma (GBM)은 뇌종양 가운데 가장 악성 종양인 grade IV glioma로서 수술, 화학 및 방사선요법 치료 후 약 14.6개월의 생존율을 갖는다 (1). 매우 낮은 생존율, 기존 항암제 치료에 대한 강력한 저항성, 그리고 암을 구성하는 세포들의 다양성 등으로 인해서 뇌종양을 극복할 수 있는 다양한 치료 전략들이 제시되고 있는 가운데 이러한 원인을 근본적으로 해결할 수 대안들 중 하나로 뇌 종양 암줄기세포 제어를 통한 치료방법이 주목을 받고 있다. (2, 3) 실제로 뇌종양 암줄기세포는 뇌 종양을 구성하고 있는 세포들 가운데 약 20% 이내로 존재하는 줄기세포의 특징을 갖는 세포들이고 암의 형성, 전이, 재발, 그리고 항암제 내성에 관여하는 것으로 잘 알려져 왔다. (2, 3). 따라서, 악성 뇌종양인 GBM을 치료하기위한 근본적인 방법은 뇌 종양 속 암줄기세포를 특이적으로 없애거나 이들 세포들을 분화시켜 기존 표준치료제로 치료하는 방법이다. 재미있는 사실은 많은 선행연구들에서 뇌 종양 암줄기세포의 기원이 되는 세포들 중 하나가 뇌 속 신경줄기세포다라는 사실과 뇌 종양 암줄기세포의 자가증식능력 유지 및 다양한 신경세포들로 분화 유도에 관련한 분자 메커니즘이 신경줄기세포와 매우 유사하다는 것이다. (4-6). 이러한 유사점들 때문에 이미 많은 선행연구들에서 뇌 종양 암줄기세포를 제어하기위해서 기존에 규명된 신경줄기세포의 세포운명결정자를 뇌종양 암줄기세포에서 타겟팅하거나 신경줄기세포 분화 유도 메커니즘을 뇌 종양 암줄기세포의 분화 유도에 적용하려는 다양한 시도들이 이뤄졌고 암 줄기세포로 인해 유발되는 항암제 내성을 극복하고자하는 노력들은 현재까지도 지속되고 있다. 

그렇다면 신경줄기세포의 어떤 세포운명결정자를 뇌 종양 암줄기세포에 적용해볼 수 있을까? 기존 선행 연구를 통해서 뇌 발생, 특히 신경줄기세포 분화 및 증식 조절에 중요한 역할을 수행하는 후성유전학적 바이오 마커로 Methyl CpG Binding Domain 3 (MBD3) 단백질을 찾아냈다 (7). 이 연구에서 뇌 발생, 그리고 신경줄기세포의 분화가 MBD3 단백질이 분해되는 기전을 통해서 조절된다는 사실을 규명했다 (7). MBD3 단백질은 Nucleosome remodeling and histone deacetylase (NuRD) 복합체의 핵심 단백질로써 줄기세포의 전능성 유지, 분화 및 세포 사멸 등과 같은 세포 운명 조절에 매우 중요한 역할을 하는 단백질로 보고되어 있다 (7-9). 지금까지 5 종류의 패밀리 단백질들 (MBD1, MBD2, MBD3, MBD4, 그리고 MeCP2)이 발견 및 보고되었고 타겟 유전자의 5’methyl-cytosine으로 변형된 CpG island와 gene body에 축적되어 있는 다른 패밀리 단백질과 달리 MBD3 단백질은 5’hydroxymethyl-cytosine으로 변형된 CpG island와 gene body에 주로 축적되어 후성유전학적 조절 기전으로 세포 운명 결정에 관여한다는 사실이 알려져 있다 (10-18). 또한, MBD3는 암세포에서도 매우 중요한 역할을 수행한다는 것이 보고 되어 있으나 아직까지 MBD3가 암줄기세포에서 어떤 역할을 수행하는지에 대한 연구는 알려진 바가 없었다. 따라서, 본 연구에서는 신경줄기세포의 자가 증식 및 분화 조절에 중요한 역할을 수행하는 MBD3 단백질의 조절 메커니즘이 뇌 종양 암줄기세포에서도 일어나는지, 뇌종양 암줄기세포에서 MBD3 단백질 대사에 대한 구체적인 메커니즘은 무엇인지, 그리고 이러한 MBD3 조절을 통해서 뇌 종양 암줄기세포가 제어되고 궁극적으로 뇌 종양 표준치료제에 대한 항암제 내성 극복과 암 재발을 억제할 수 있는지에 대한 질문들을 가지고 연구를 수행했다.

연구결과 

1. 뇌 종양 암줄기세포 분리 및 MBD3 기능

뇌 종양 조직 및 세포로부터 뇌 종양 암줄기세포 분리에 가장 흔하게 사용된 방법은 암줄기세포에 특이적으로 발현하는 세포 표면 마커에 결합하는 항체를 활용하여 분리하는 것이다. 대표적인 뇌 종양 암줄기세포 분리 항체로 CD133 (prominin-1) 항체를 많이 활용하지만 많은 연구들로부터 CD133 마커에 대한 신뢰성 문제가 야기되어왔다 (19-21). CD133 항체의 경우 뇌 종양 세포주 및 종양 조직으로부터 면역염색을 통한 분석 시 전체 암에서 적게는 20%에서 많게는 거의 90% 정도로 염색되는 결과들을 통해서 CD133 항체의 특이성에 대해 적잖은 지적을 받아 왔다. 따라서 본 연구에서는 보다 정확하고 특이적인 암줄기 세포 분리를 위한 바이오 마커 발굴 스크리닝을 실시했다. 먼저 정상 및 뇌 종양 환자 샘플을 활용하여 RNA sequencing 분석을 실시했고 정상 샘플보다 뇌 종양에서 10배 이상 증가되면서 통계적으로 유의성이 높는 마커들을 선별했으며 Human protein atlas와 Tissue microarray 분석을 통해서 최종적으로 CD133, CD44 그리고 CXCR4라는 세 개의 세포 표면 마커들을 찾아냈다 (그림 1). 이들 바이오 마커들을 조합하여 결국 CD133, CD44, 그리고 CXCR4 세 가지 바이오 마커들이 동시에 발현하고 있는 세포가 유력한 뇌 종양 암줄기세포임을 in vitro와 in vivo 동물실험을 통해서 규명했다 (그림 1). 

다음으로 새롭게 규명한 뇌 종양 암줄기세포가 정말 신경줄기세포처럼 신경세포들로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있는지를 검증하기위해서 뇌 종양 암줄기세포를 분화 배양 배지에서 5일간 배양했고 분화능력을 관찰했다. 뇌 종양 암줄기세포는 CD44, CD133, CXCR4와 같은 뇌종양 암줄기세포 마커 및 Nestin과 같은 신경줄기세포 마커를 강하게 발현하고 있다가 5일간 분화시킨 세포에서는 급격히 발현량이 감소했다 (그림 2). 또한, 신경분화 마커인 TUJ1, 성상세포 마커인 GFAP, 아교세포 마커인 MBP의 발현이 5일간 분화시킨 조건에서 증가되었다 (그림 2). 그리고 이러한 뇌 종양 암줄기세포의 분화능력은 qPCR 분석을 통해서 한번 더 검증되었다 (그림 2). 무엇보다 중요한 사실은 선행연구에서 관찰한 MBD3 단백질이 높은 레벨로 신경줄기세포에서 발현하고있었던 유사하게 뇌 종양 암줄기세포에서도 MBD3 단백질이 매우 높은 레벨로 발현되어 있었다는 점이고 신경줄기세포에서와 마찬가지로 뇌 종양 암줄기세포에서도 분화되는 조건에서 급격히 감소되는 현상이 관찰했다 (그림 2). 또한, 유세포분석 장비를 활용한 MBD3 발현 레벨에 따른 암줄기세포 마커 발현 분석과 자기증식능력 실험을 통해서 MBD3가 뇌 종양 암줄기세포의 자가 증식과 분화 조절에 중요한 역할을 수행한다는 증거들을 포착했다 (그림 2) 

2. MBD3 조절 메커니즘 규명

MBD3 단백질의 조절을 통해서 뇌 종양 암줄기세포를 제어할 수 있는 실마리를 얻었기 때문에 신경 줄기세포에서 관찰했던 MBD3 단백질 분해 기전이 뇌 종양 암줄기세포에서도 동일하게 재현되는지를 분석했다. 신규 단백질 합성 억제제인 Cyclohexamide (CHX) 화합물만 처리한 대조군에서 MBD3 단백질 레벨이 시간에 따라 감소된 것에 반해 CHX와 단백질 분해 억제제인 MG132를 동시에 처리했을 때 MBD3 단백질 분해가 더 이상 유도되지않는 것을 통해서 MBD3 단백질은 프로테아좀에 의해 단백질 분해가 이뤄진다는 사실을 확인했다 (그림 3). 또한, 유비퀴닌화 분석 실험을 통해서 MBD3 단백질 분해가 유비퀴틴 의존성 프로테아좀 기전을 통해서 이뤄진다는 사실을 증명했다 (그림 3).

그러면 구체적으로 어떠한 결합 인자들을 통해서 MBD3 단백질의 유비퀴틴화 및 프로테아좀성 분해조절이 이뤄지는지를 탐색하기위해서 프로테오믹스 분석을 실시했고 CK1α, β-TrCP, SKP1, CUL1,2,3,4,5등과 같은 MBD3 단백질과 결합하는 단백질들을 발굴했다. 결론적으로 CK1α 단백질이 MBD3 단백질의 N-term 말단에 위치한 Serine 39, 45, 85, 그리고 106번 잔기에 인산화를 유도하면 E3-ubiquitin ligase인 β-TrCP 단백질이 결합되고 이어서 유비퀴틴화에 의한 프로테아좀성 단백질 분해가 개시된다는 것을 확인했다 (그림 4). 또한, 이러한 현상은 제1세대 CK1α activator이면서 FDA에 승인된 약물인 Pyrvinium pamoate (Pyrpam)를 처리했을 때 촉진되었고 MBD3의 유비퀴틴화 및 단백질의 분해가 유도되는 것을 확인했다 (그림 4) 

3. MBD3 조절에 의한 뇌 종양 암줄기세포 제어 및 항암제 내성 극복

뇌 종양 암줄기세포에 MBD3가 매우 높은 레벨로 발현 되어있고 뇌 종양 암줄기세포의 자가 증식 능력과 MBD3 단백질 발현 정도가 매우 밀접한 관련성을 가지고 있었기 때문에 뇌 종양 성장 억제에 있어서 MBD3가 어떤 기능을 갖는지 분석했다. 특히, DNA repair 효소인 O⁶-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT)가 높은 레벨로 발현 되어 있는 뇌 종양의 경우 기존 뇌종양 표준 치료제에 내성을 갖는다. 재미있게도 기존 항암제 내성을 갖는 MGMT가 높은 레벨로 발현되어 있는 뇌 종양 암줄기세포라고 하더라도 MBD3 발현을 억제 시키면 뇌 종양 세포 성장이 감소된다는 것을 콜로니 형성 분석법을 통해 확인했다 (그림 5). 또한, qPCR 분석을 통해서 MBD3 발현 억제 시 뇌종양 암 줄기세포 마커인 CD133, CD44, CXCR4와 배아줄기세포 마커인 OCT4, SOX2의 발현 레벨이 감소되어 줄기세포의 성질을 잃는다는 것을 확인했다 (그림 5). In vitro에서 관찰된 이와 같은 결과들은 In vivo 동물 실험 분석을 통해서도 확인됐다. MGMT가 높은 레벨로 발현된 뇌 종양 세포를 이식한 이종이식 뇌종양 동물 모델를 활용한 실험에서 shMBD3 렌티바이러스 벡터를 활용하여 MBD3 발현을 저해 시켰을 때 대조군에 비해 암 성장이 현저히 감소했고 이는 MBD3의 발현 억제가 항암제 내성 뇌종양의 성장을 저해시킬 수 있음을 의미한다. 또한, 조직면역학적 분석법을 통해서 shMBD3군에서 대조군인 shScramble에 비해 항암제 내성의 원인이 되는 뇌종양 암줄기세포 마커인 CD133, CD44, CXCR4와 신경줄기세포와 세포증식 마커인 Nestin, Ki67을 동시에 발현하는 세포들 수가 현격히 감소했고 이는 MBD3 발현 억제가 뇌종양 암줄기세포의 성장을 저해함으로서 항암제 내성를 극복할 수 있다는 것을 의미한다 (그림 5). 

CK1α 활성화를 통한 유비퀴틴 의존성 프로테아좀 머신어리를 통해서 MBD3 단백질은 조절되고 MBD3 단백질의 분해는 뇌종양 암 줄기세포 증식 억제 및 분화 유도와 밀접한 관련을 갖는다. 이번에는 shMBD3 렌티바이러스 벡터에 의한 MBD3 발현 억제가 아니라 CK1α 활성화를 유도하는 화합물을 처리하였을 때 뇌종양의 성장 억제 효능에 대한 연구를 동물모델에서 수행했다. 기존 표준치료제인 Temozolomide (TMZ)는 MGMT를 높은 레벨로 발현하는 뇌종양 세포에 내성을 가지고 있기 때문에 이종이식 동물모델에서도 TMZ 처리에 의한 뇌 종양 성장 억제 효능은 관찰되지않았다. 그러나 CK1α 활성화 유도 화합물인 pyrvinium pamoate (Pyrpam)을 처리한 군의 경우 뇌종양의 성장 억제 효능이 뚜렷하게 관찰되었고 면역형광 염색을 통해서 MBD3 단백질 레벨 감소와 함께 뇌종양 암줄기세포 발현도 현저히 감소되었다 (그림 6). 이러한 결과는 세포주를 활용한 이종이식 동물모델에서 뿐만 아니라 실제 임상에서 뇌 종양 환자의 수술을 통해서 확보한 뇌종양 암조직 기반 세포를 활용한 이종이식 동물모델에서 동일하게 관찰되었다 (그림 6).  

4. MBD3 조절에 의한 뇌 종양 암줄기세포 제어 및 항암제 내성 극복을 위한 Downstream기전

앞선 실험에서 관찰한 MBD3 단백질 분해를 통한 뇌 종양 암줄기세포 분화 유도와 관련한 downstream 조절 기전을 찾기 위해서 뇌종양 암줄기세포 샘플과 MBD3 항체를 활용하여 CHIP-sequencing분석을 실시했고 MBD3 단백질이 신경 분화 마커들인 DLX1, TUJ1, LBX1, 그리고 GFAP 유전자 프로모터와 유전자 바디 지역에 많이 축적되어 있음을 확인했다 (그림 7). 이전 많은 연구들에서 MBD3 단백질은 NuRD 복합체의 핵심 단백질로써 MBD3/NuRD 복합체는 주로 타겟 유전자 프로모터 주변에 결합하여 유전자 발현을 억제시키는 전자 억제자로서의 기능을 갖는다는 것이 보고되어 있다. 따라서, 본 연구에서 활용한 shMBD3 렌티바이러스 벡터 혹은 Pyrpam 처리에 의해서 유도된 MBD3 단백질 감소는 MBD3/NuRD 복합체를 해체시키고 전사 억제자로서의 기능을 상실시켜 결국 타겟 유전자들인 DLX1, TUJ1, LBX1, 그리고 GFAP 유전자 발현을 촉진시켜 뇌종양 암줄기세포의 분화를 유도하고 암 성장을 억제 시킨다는 것을 확인했다. 

연구의 성과 및 의의

본 연구는 뇌 종양 항암제 내성 및 치료 후 암의 재발에 중요한 원인으로 알려진 뇌 종양 암줄기세포를 타겟팅 할 수 있는 새로운 치료 전략를 제시했다 (그림 8). 이를 위해서 기존에 알려진 뇌 종양 암줄기세포 바이오 마커보다 더 특이적으로 암줄기세포를 분리할 수 있는 새로운 마커들을 규명했고 암줄기세포의 분화 유도 및 성장을 억제시킬 수 있는 후성 유전학적 조절 바이오 마커인 MBD3의 단백질 분해 조절 기전을 규명했다. 또한, 프로테오믹스 분석을 통해서 MBD3 단백질 결합 파트너인 인산화 단백질 CK1α의 발견은 CK1α 활성화 유도 화합물이 기존에 알려진 것처럼 Wnt/β-catenin 신호전달계 활성 억제 기전을 통해 암의 성장을 저해한다는 해석뿐 만 아니라 MBD3 단백질 분해를 촉진시켜 암 줄기세포 분화 유도 및 성장 억제를 통해 항암제 내성 극복 및 치료 효능을 가질 수 있다는 새로운 관점을 제시했다. 마지막으로 본 연구에서 활용한 CK1α 활성화 유도 화합물인 Pyrvinium pamoate는 FDA에 승인된 약으로 임상적 활용가치가 매우 높지만 BBB (Brain Blood Barrier)를 통과할 수 없었기 때문에 이 약물은 실제 약물 전달 문제로 인해 뇌종양 이종이식 동물 모델에 활용하기 어려웠다. 하지만 본 연구에서는 약 한 달 동안 뇌 속으로 약물이 일정하게 전달될 수 있는 Osmotic pump 시스템 (0.11ul/hr씩 전달)을 도입하여 동물에 이식함으로써 약물전달 문제를 극복했다. 또한, 최근에 2 세대 CK1α 활성화 유도 화합물인 SSTC3가 BBB를 통과할 수 있다는 결과가 보고되었기 때문에 본 연구에서 관찰한 결과를 향후 교차 검증할 수 있을 것으로도 기대된다. 마지막으로 본 연구에서 제시하고 있는 β-TrCP/CK1α/MBD3/NuRD 세포 신호전달 기전은 뇌 종양 암줄기세포 조절 뿐 만 아니라 MBD3 발현과 병리학적 증상에 유의성을 갖는 다른 질환 치료제 개발 전략에도 적용될 수 있을 것으로 기대된다.

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