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우수논문소개

신약개발에 필수적인 증식 가능한 고기능의 간 오가노이드 개발

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    관리자
  • 작성일자

    2019-12-13
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    1539

신약개발에 필수적인 증식 가능한 고기능의 간 오가노이드 개발

Generation of expandable human pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like liver organoids

 

Journal of Hepatology 71: 970-985, 2019

 

 

 

 

 

 

문선주, 한국생명공학연구원 줄기세포융합연구센터 UST 학생 sjmoon@kribb.re.kr 

손명진, 한국생명공학연구원 줄기세포융합연구센터 선임연구원 mjson@kribb.re.kr

 

 

연구배경

지난 25년간 비임상을 통과한 약물들이 시장에서 퇴출되는 비율이 20% 이상이고, 간독성이 그 주요 원인 중 하나로, 신약개발 초기 단계에서 정확한 간독성·유효성 예측이 가능한 평가 모델이 반드시 필요하다(1). 인간의 간 조직에서 직접 분리한 일차배양 간세포(primary human hepatocytes, PHHs)가 약물대사능 등의 생체유사도가 높아 현재까지 표준모델(gold Standard)로 사용되고 있으나, 인간 간 조직 수급이 제한적이고, 특히 PHHs는 체외에서 전혀 증식하지 않는 한계가 있었다. 또한, 현재 사용되고 있는 2D 세포기반 모델은 조직의 복합성 및 생체 반응을 구현하지 못하고, 동물모델은 종(species)차에 의한 인체 반응 예측에 한계가 있어 새로운 인체 모사 모델이 요구되어 왔다. 간 질환연구에 있어서도, 동물모델을 이용한 치료제 개발 연구가 장기간 수행되어 왔으나 임상에서 효과적인 치료제가 사실상 부재하고, 동물실험 반대 여론 및 규제 또한 강화되고 있어, 동물실험을 보완할 수 있는 인간 세포/조직 기반의 모델이 요구되고 있는 실정이다.

오가노이드는 배아줄기세포가 인간 개체로 발생되는 과정을 시험관 내에서 모사하여 제작하는 미니 장기유사체로, 개인맞춤 모델제작이 가능하고, 조직 내 주요 세포들의 상호작용 및 발생 단계/질환 진행 과정의 복합성 모사가 가능한 생체유사도가 높은 3D 모델이다(2, 3). 그러나, 대부분의 전분화능 줄기세포*(pluripotent stem cells) 기반 오가노이드는 현재 임신 2-3기 태아 수준의 미성숙 상태로(4), 성인에서의 약물 반응을 테스트하기위해서는 반드시 오가노이드를 성숙화(maturation) 시키는 기술이 필요하다(5). 즉, 인체모사 간 모델에 요구되는 핵심 기술은, 대량으로, 정확한 약물반응 예측이 가능한가, 즉 “증식 가능”한 모델이고 “기능적으로 성숙화” 되어있는가 이다.

*전분화능 줄기세포: 인체의 거의 모든 신체 세포로 분화가 가능한 줄기세포로서, 배아줄기세포 및 역분화 줄기세포/유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPSCs, 완전히 분화가 끝난 체세포를 배아줄기세포 상태로 역분화 시킨 세포, Shinya Yamanaka가 2012년 노벨상 수상)가 전분화능 줄기세포에 해당하며, 특정 세포로만 분화 가능한 성체 줄기세포와 구별된다.

 

 

 

연구결과

1. 인간 전분화능 줄기세포를 이용하여 증식 가능한 간 오가노이드 제작

본 연구에서는 기존 2차원 간세포 분화 기술과(temporal cues), 3차원 오가노이드 배양기술을(special cues) 조합하여, 발생 단계별 시공간의 변화를 최적화해 줌으로써, 인간 전분화능 줄기세포로부터 증식 가능하고 기능적으로 성숙한 간 오가노이드를 제작하는데 성공하였다(그림 1) (6). 제작된 간 오가노이드는 3D cyst 형태의 구형체 모양으로, 간세포 특이적인 마커를 발현하고 있으며 체외에서 10개월 이상 증식이 가능하다. 부유(suspension) 상태나 매트리젤에 embedding한 상태로 배양하며, 크기가 충분히 커진 오가노이드는 분해 효소 또는 수술용 칼을 이용하여 나누어 주면서 증식 시킨다. 또한 동결 보존 이후에도 간 오가노이드의 특성 및 정상 염색체 핵형이 잘 유지됨을 확인하였다. 즉, 대량생산 후 장기간 동결 보존하면서 사용할 수 있는 실용성 있는 모델이다.

 

 


 

그림 1. 간 오가노이드 제작 모식도 및 대표사진

(A) 제작단계 모식도, (B-D) 오가노이드 대표사진, (E) 오가노이드 증식능 확인 (F) 대표마커 발현확인 (G) 동결 해동 후 오가노이드 사진

 

 

 

2. 간세포 모델로의 기능 검증

 

 

그림 2. 간 오가노이드 기능 검증

(A) 글라이코겐 저장 능력 확인, (B) ICG uptake 검증, (C) 알부민 (D) AAT (E) Urea 분비능, (F) 세포 호흡 검증 (G) CDFDA 염색 후 사진,

(H-I) 간 조직과의 유사도 평가. ALO, adult liver organoid: DM, differentiation medium: EM, expansion medium: HM, hepatic medium: MH, mature hepatocytes

 

제작된 간 오가노이드는 글라이코겐 합성능력, ICG uptake, 알부민, AAT 및 urea 분비 등의 간세포 모델로써의 기능이 우수하였고, 특히 2D로 분화시킨 간세포뿐만이 아니라, PHHs나 성인의 간 조직 세포로부터 제작한 성체줄기세포 유래의 오가노이드와( )(7) 비교하여도, 알부민, AAT 분비 및 세포 호흡 기능 등이 뛰어남을 확인하였다(그림 2). 특히, 3차원 구조 측면에서도 담즙산을 배출하는 담세관(bile canaliculi)과 같은 구조를 기존 2D PHHs 모델에서는 관찰하기 힘든 반면, 본 연구에서 제작된 간 오가노이드 내부에는 담세관이 잘 형성되어 있고, 세포가 조직 내에서와 유사하게 기능적으로 polarization 되어 있는 것을 확인하였다. 또한, 분화도를 인간 간조직에서만 발현되는 유전자 패널(Liver specific gene expression panel, LiGEP)을 제작하여(8) 비교하였고, 기존 2D 방법으로 분화시킨 간세포의 간 조직과의 유사도가 31%인데 반해, 본 연구에서 제작된 간 오가노이드의 유사도는 60% 이상임을 정량적으로 평가하였다.

 

 

3. 간 오가노이드를 활용한 간 독성평가

기존 2차원 방법으로 분화시킨 간세포 대비, 간 오가노이드에서 주요 약물대사 효소들의 발현과 활성이 높음을 확인하였고, testosteron의 경우 2D 분화 간세포는 전혀 약물을 대사시키지 못하는데 반해, 오가노이드에서는 대사를 시킨 후 대사체를 형성하는 것을 확인하였다(그림3).

 

 

그림 3. 간 오가노이드를 활용한 간 독성평가

 

 (A) 오가노이드에서 Phase I, II 약물대사 효소의 발현 증가, (B) CYP3A4 (C) CYP1A2 활성 검증,

(D) testosterone 약물대사능 검증 (E) troglitazone 독성평가 (F-H) trovafloxacin 독성평가

 

특히, 기존 2D 모델을 사용한 비임상 평가에서는 독성을 나타내지 않아 신약으로 출시되었으나, 시장 출시 후 환자의 간독성 사망 사고를 일으키고 퇴출된 당뇨치료제 troglitazone과 항생제 trovafloxacin을 예시 약물로 사용하여 독성평가를 실시한 결과, 기존 모델에서는 독성을 보이지 않던 인체 허용량 이하의 농도에서도 오가노이드의 형태 및 핵 손상, 활성산소의 증가, GSH 레벨 감소, 생존률 및 마이토콘드리아 기능 감소등의 독성 반응을 검출할 수 있었다. 반면 현재도 사용되는 levofloxacin과 같은 항생제에 대해서는 독성을 보이지 않았다. 즉, 본 오가노이드 모델은 약물에 대한 독성 반응을 인체에서와 유사하게 나타냄을 확인하였고, 실시간의 high content screening (HCS) 기반으로 보다 정확한 간독성 예측 모델로 활용할 수 있을 것으로 기대된다.

 

 

4. 간 오가노이드를 이용한 지방간(fatty liver) 모델 제작 및 지방간 치료제 스크리닝

유전체 및 대사체 분석 결과, 제작된 간 오가노이드에서 지방 대사 효소 발현 및 지방산 전구물질이 증가되어 있음을 확인하여, 이후 지방산을 다량 처리한 후 지방간 오가노이드를 제작하였다. 지방산 처리 후, 지방간의 표현형과 유사하게 세포 내의 지방소립(lipid droplet) 및 트리글리세라이드(Triglyceride,TG)의 증가를 확인하였고, 마이토콘드리아의 기능이 손상되어 세포 호흡이 현저하게 감소됨을 확인하였다. 또한 지방이 축적된 지방간 오가노이드에서는 글루코즈 흡수 및 대사능이 현저히 떨어져 있는 상태로, 지방간 환자가 보이는것과 유사한 비정상적 글루코즈 대사 특성도 관찰 가능하였다. 이렇게 제작된 지방간 오가노이드 모델을 활용하여, 지방 축적을 억제 시킬 수 있는 약물들을 오토파지 라이브러리 중에서 스크리닝 하였고, 그 중 가장 효과가 뛰어난 것으로 선정된 두 가지 약물은 이미 지방간 억제 효능이 보고되어 있는 약물로, 본 연구팀이 제작한 질환모델의 신뢰도 및 활용도를 검증하였다.

 

그림 4. 지방간 오가노이드 제작 및 치료제 발굴

(A) 오가노이드에서 지방 대사 유전자 발현의 증가, (B) 지방간 모델 제작 (C) 지방간 오가노이드에서 트리글리세라이드 증가

(D) 지방간 오가노이드에서 세포 호흡 저해, (E-G) 지방간 치료제 발굴 및 검증

 

 

 

연구의 성과 및 의의

인체모사 간 모델 제공 : 간독성 평가 및 간질환 치료제 개발에 활용

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그림 5. 개인 맞춤형 간 오가노이드 제작 및 활용 모식도

 

 

본 연구에서는 증식하지 않고 기능적으로 미성숙한 기존 간 오가노이드 모델(4) 대비, 증식(self-renewal) 가능하고 고기능(functional)인 간 오가노이드를 전분화능 줄기세포로부터 제작하는 기술을 개발하였고, 특히, 오가노이드가 성숙화 될수록 인체와 유사한 약물 반응을 분석할 수 있어 보다 정확한 간독성 평가가 가능함을 확인하였다. 또한, 정상 뿐만이 아니라 지방간과 같은 질환 모델링(disease modeling)이 가능하여, 개인맞춤 독성 및 약효 평가(personalized drug toxicity and efficacy screening) 플랫폼으로 활용 가능 가능함을 입증하였다. 

본 오가노이드 모델은 인체와 보다 유사한 개인 맞춤형의 인체 모사 간 모델을 제공함으로써, 대량으로 정확한 약물반응 예측을 가능하게 하고 신약의 부작용을 줄임으로써 개인맞춤 신약개발을 앞당기는데 기여할 수 있을 것으로 기대된다. 특히, 인체 세포 기반으로 동물실험과 임상시험의 간극을 메우는데 활용도가 높을 것으로 기대되며, 신약개발 초기 단계에서 위험성을 줄이고 성공률을 높임으로써 신약개발 효율성 향상에 기여할 것으로 기대된다. 또한, 제작 방법 및 증식이 쉬운 모델로, 생체모사 신약개발 플랫폼 제작의 수월성을 확보한데 또 다른 의미가 있으며, 뿐만 아니라 발생 단계 및 질환 진행 과정, 조직 재생 과정의 이해 등을 통한 관련분야 원천기술 연구 및 치료제 개발 연구에도 활용가치가 클 것으로 예상된다.

 

 

참고문헌

1. Goldring C, Antoine DJ, Bonner F, Crozier J, Denning C, Fontana RJ, Hanley NA, Hay DC, Ingelman-Sundberg M, Juhila S, Kitteringham N, Silva-Lima B, Norris A, Pridgeon C, Ross JA, Young RS, Tagle D, Tornesi B, van de Water B, Weaver RJ, Zhang F, Park BK. Stem cell-derived models to improve mechanistic understanding and prediction of human drug-induced liver injury. Hepatology. 2017;65(2):710-721.

2. Fatehullah A, Tan SH, Barker N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nat Cell Biol. 2016;18(3):246-54.

3. Li M, Izpisua Belmonte JC. Organoids - Preclinical Models of Human Disease. Reply. N Engl J Med. 2019;380(20):1982.

4. Takebe T, Sekine K, Enomura M, Koike H, Kimura M, Ogaeri T, Zhang RR, Ueno Y, Zheng YW, Koike N, Aoyama S, Adachi Y, Taniguchi H. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 2013;499(7459):481-4.

5. Chen C, Soto-Gutierrez A, Baptista PM, Spee B. Biotechnology Challenges to In Vitro Maturation of Hepatic Stem Cells. Gastroenterology. 2018;154(5):1258-1272.

6. Mun SJ, Ryu JS, Lee MO, Son YS, Oh SJ, Cho HS, Son MY, Kim DS, Kim SJ, Yoo HJ, Lee HJ, Kim J, Jung CR, Chung KS, Son MJ. Generation of expandable human pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like liver organoids. J Hepatol. 2019;71(5):970-985.

7. Huch M, Gehart H, van Boxtel R, Hamer K, Blokzijl F, Verstegen MM, Ellis E, van Wenum M, Fuchs SA, de Ligt J, van de Wetering M, Sasaki N, Boers SJ, Kemperman H, de Jonge J, Ijzermans JN, Nieuwenhuis EE, Hoekstra R, Strom S, Vries RR, van der Laan LJ, Cuppen E, Clevers H. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 2015;160(1-2):299-312.

8. Kim DS, Ryu JW, Son MY, Oh JH, Chung KS, Lee S, Lee JJ, Ahn JH, Min JS, Ahn J, Kang HM, Kim J, Jung CR, Kim NS, Cho HS. A liver-specific gene expression panel predicts the differentiation status of in vitro hepatocyte models. Hepatology. 2017;66(5):1662-1674.

 

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