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우수논문소개

세포 간 결합 구조인 adherens junction에 의한 단백질 공간적 구획화 및 단백질 분해 hotspot 형성을 통한 Notch 신호전달 기전의 연구

  • 작성자

    곽민석 (연세대학교 고등과학원 Nano-Biomedical Engineering 학과)
  • 작성일자

    2023-03-24
  • 조회수

    2604

세포 간 결합 구조인 adherens junction에 의한 단백질 공간적 구획화 및 

단백질 분해 hotspot 형성을 통한 Notch 신호전달 기전의 연구
Adherens junctions organize size-selective proteolytic hotspots critical for Notch signalling
Nature Cell Biology 24, 1739–1753, 2022

 

곽민석
연세대학교 고등과학원 Nano-Biomedical Engineering 학과 
minsuk.kwak@yonsei.ac.kr

연구배경
 물리적으로 직접적인 접촉을 하는 세포 사이에서 일어나는 juxtacrine 신호 전달은 다중세포 생물에서 발생하는 발생, 생리 및 질병과 관련된 다양한 세포과정을 조율한다 (1). Notch 신호전달은 세포 분열과 증식, 세포간 통신에 중요한 접촉 의존성 juxtacrine 신호로 알려져 있다 (2). 또한 줄기 세포의 pluripotency를 조절하여 다양한 종류의 세포 분화와 조직 발달 과정에 매우 중요한 역할을 한다 (3). 잘못된 Notch 신호는 암 및 발달 장애 등 다양한 질병의 직접적인 원인이 된다 (4). Notch 신호 활성화 과정은 독립적으로 제어되는 여러 분자적 단계를 순차적으로 거쳐 이루어진다 (그림 1) (5). 첫째, 리간드-수용체 결합에 의한 물리적 힘이 Notch 수용체의 NRR 도메인으로 전달되어 구조 변화를 기계적으로 유도한다. 둘째, NRR 구조 변화로 인하여 숨겨져 있던 S2 사이트가 외부로 유출되어 ADAM metalloprotease에 의하여 첫번째 단백질 분해가 진행된다. S2에 대한 ADAM의 절단 과정은 γ-secretase에 의한 막 내부 (intramembrane) S3에서의 단백질 분해를 유도한다. 최종적으로 세포-내부-도메인 (ICD)이 세포막으로부터 해방되어 핵으로 이동하여 전사 입자로써 타겟 유전자 발현을 조절한다 (그림 1) (5).
 그러나 리간드와 상호 작용 이후 Notch 수용체의 순차적 절단 과정이 시공간적으로 정밀하게 제어되는 분자학적 메커니즘은 정확히 규명되지 않았다 (6). 특히 γ-secretase은 ADAM에 의한 S2 절단 과정을 거친 중간단계 Notch 수용체만을 정확하게 구분하여 S3 cleavage를 유도하는데, 이러한 substrate selection 메커니즘은 정확히 알려지지 않았다 (그림 1, 적색 라인 하이라이트). 

 



그림 1. 노치 수용체 신호 전달 체계. 본 연구에서는 특히 리간드에 의하여 기계적 활성화된 노치가 ADAM10/17 그리고 γ-secretase에 의하여 순차적으로 분해되어 최종적으로 ICD를 형성시키고 타겟 유전자의 전사를 조절하는 과정을 조정하는 기작을 규명하였다. 

 본 연구에서는 세포 간 결합 구조인 접착연접 (adherens junctions, AJ) 에 의해 형성된 membrane compartments가 Notch 분자의 순차적인 proteolysis 과정을 위한 특수한 미세 환경을 제공함을 규명하였다. AJ 구조는 서로 이웃한 두 세포막이 화학적, 공간적, 기계적으로 결합되며 형성되며, 이 때 cell signal-exchange 인터페이스는 dynamic하게 재구성이 된다 (7). 세포는 signal-exchange 인터페이스 재구성을 통하여 단백질 및 지질 요소의 공간적 배열과 기능을 제어함과 동시에, 수용체 활성화 및 하위 신호 전달에 특성화된 세포막 구역을 형성한다. AJ에 의한 2가지 compartments는 서로 다른 물리적, 생화학적 성질을 가지고 있으며, Notch 활성화에 필요한 두 차례의 proteolysis 과정이 각각의 compartment에서 공간적으로 분리되어 일어남을 확인하였다. 메카노제네틱스 (mechanogenetics) 나노기술을 이용한 신호 전달 단백질의 공간적 재배열 및 CRISPR-Cas9 유전자 편집과 같은 최첨단 기술을 활용하여, AJ에 의한 membrane compartment 형성의 생물 물리학적 기전을 제시하였다. 

연구결과
1. Notch 수용체 proteolysis 과정은 구분된 membrane compartment에서 일어난다
 먼저 Notch 수용체, Delta 리간드, ADAM, 그리고 g-secretase 등 신호 전달에 관여하는 분자들의 세포막 위에서 공간적 분포를 조사하였다. 우리는 세포간 인터페이스에서 높은 수준의 Notch와 Delta 형광 신호를 관찰함으로써, 리간드-수용체 pair가 공간적으로 공존하며 세포 인터페이스에 축적됨을 확인하였다. 흥미롭게도 리간드-수용체가 공존하며 축적된 지역에서는 g-secretase 신호가 관측되지 않는 반면, 높은 g-secretase 신호가 측정된 공간에서는 리간드-수용체 신호가 배제되어 있으며 100 nm – 1 µm 범위의 도메인 (마이크로-도메인)을 형성함을 확인하였다 (그림 2a,b). 
 우리는 축적된 γ-secretase의 신호가 강하게 관측되는 동시에, Notch-ligand pair가 배제되어 있는 세포막 마이크로-도메인이 cadherin 결합인자로 구성된 AJ와 공간적으로 공존하는 것을 확인하였다 (그림 2c,d). 따라서 AJ 구조는 두 개의 기능적으로 구분된 미세환경을 가진 compartments를 형성하고, Notch 신호 전달 과정에서 필수적인 리간드-수용체 상호작용 및 ADAM에 의한 첫번째 단백질 절단과정 (Ligand-Receptor Engagement, LRE)과 γ-secretase에 의한 두번째 단백질 절단과정 (Regulated Intramembrane Proteolysis, RIP)이 서로 다른 compartment에서 일어남으로써 Notch 활성화를 조절한다는 사실을 밝혀냈다. 이 때 Notch 수용체가 LRE가 일어나는 도메인 (LRE-µdomain)에서 γ-secretase와 높은 연관성을 보이는 도메인 (RIP-µdomain)으로 이동하는 과정은 Notch 수용체와 γ-secretase 간 상호작용을 조절하여 순차적인 proteolysis 단계를 조율하는 “spatial switch”로 작용한다. 

 
그림 2. Cadherin 기반 AJ에 의한 두 개의 compartment(구획)를 형성하여 Notch의 순차적 proteolysis를 조정한다. (a) 서로 다른 공간에서 일어나는 Notch의 순차적 활성화 과정 schematics. (b) 노치와 델타가 축적된 LRE 도메인과 γ-secretase(PS1)가 축적되었지만 노치와 델타는 배제된 RIP 도메인은 distinctive한 세포막 구획임을 보여주는 대표 이미지. (c) AJ에 의한 LRE와 RIP 도메인 형성 및 Notch-Delta와 γ-secretase의 공간적 분리 schematics. (d) PS1이 관측되는 RIP와 Notch/Delta가 관측되는 LRE 도메인의 AJ에 대한 상대적인 위치를 보여주는 이미지.  

2. AJ 기반의 마이크로-도메인의 형성 원리와 기능
 AJ 구조와 공간적으로 공동화 (colocalize) 된 RIP µdomain은 많은 양의 γ-secretase가 축적되어 있다. 콜레스테롤과 sphingolipid이 높은 함량으로 포함된 detergent-resistant lipid microdomain와 γ-secretase가 강한 연관성을 가진다는 이전 연구에 기반하여 (8), 우리는 AJ 구조가 lipid microdomain 형성을 유도하고 구조를 안정화 시킴으로, γ-secretase가 RIP 마이크로-도메인에서의 축적되는데 중요한 역할을 한다고 추측하였다. 이를 증명하기 위하여, 본 연구진이 개발한 나노입자를 이용하여 특정 수용체에 기계적, 시공간적 자극을 전달할 수 있는 메카노제네틱스 기술을 이용하여 cadherin 단백질을 세포내 공간에 높은 밀도로 모집하여 클러스터를 유도하고 인공적인 AJ를 형성하였다(9) (그림 3a,b). 우리는 lipid microdomain과 γ-secretase가 인공-AJ에 높은 농도로 모집되어 공간적으로 공존한다는 것을 확인하였다(그림 3c).  


 
그림 3. AJ는 ordered lipid microdomain의 형성과 안정화를 유도하여 γ-secretase을 축적한다. (a) 메카노제네틱스를 이용한 인공 AJ 형성과 lipid microdomain과 γ-secretase의 공간적 분포 관측 schematics. (b) 메카노제네틱스를 이용한 인공 AJ 형성을 보여주는 이미지. (c) 인공 AJ에 Flot1과 PS1 신호가 colocalize되었으며 MβCD 처리하였을 때, PS1이 인공 AJ로 모이지 않는 것을 통하여 γ-secretase는 lipid microdomain과 함께 AJ로 recruit됨을 확인하였다. 

 다음으로 Notch 수용체와 리간드가 어떠한 이유로 AJ로부터 공간적으로 배제되어 RIP 도메인과 공간적으로 분리된 공간인 LRE 도메인을 형성하는지 확인하였다. 우리는 Notch 수용체와 Delta 리간드가 각각 100-150 nm 와 30 nm 이상이라는 점에 착안하여, 세포 사이 25 nm 이하 좁은 간극에 형성되는 AJ에는 위 두 단백질은 물리적으로 접근하기 어려워 공간적으로 배제될 것이라는 가설을 세웠다. 이러한 현상을 size-dependent protein segregation 이라고 하며, 다른 종류의 juxtacrine 신호 전달, 특히 T 세포 수용체 신호 활성화를 정밀 제어하는데 중요한 역할을 한다. 위 가설을 확인하기 위해서 우리는 메카노제네틱스를 이용하여 인공 AJ를 형성하였을 때, Notch 수용체의 공간적 분포를 확인하였고, 흥미롭게도 아주 높은 Notch 신호가 인공 AJ에서 관측되었다 (그림 4a,b). 이는 Notch 수용체가 공간적으로 배제되어 있는 실제 AJ와는 반대되는 현상으로, 사이즈가 큰 Notch 수용체가 접근할 수 없는 실제 AJ와 달리 인공 AJ는 좁은 간격 (intermembrane cleft)이 없어 Notch 수용체가 인공 AJ에 집중된 γ-secretase에 접근할 수 있다고 추론했다. 이를 확인하기 위하여 다양한 크기의 Notch 변형체와 AJ의 공간적 배열을 비교하고 리간드가 없을 때의 Notch 신호 활성화 정도를 측정하였고, 그 결과 Notch의 크기가 작아질 수록 AJ와 높은 비율로 colocalize 되며 (그림 4c,d), 리간드 없이도 Notch 신호 활성이 됨을 확인하였다 (그림 4e).  


 
그림 4. 단백질 크기에 의한 AJ의 노치 수용체 공간적 배제. (a) Mechanogenetics를 이용한 인공 AJ와 노치의 공간적 분포 관측. (b) 인공 AJ와 노치 수용체가 공간적으로 공존함 확인. (c) 다른 크기의 노치 variant와 AJ의 간격의 상대적 비교. (d) 세포간 간격보다 크기가 더 큰 노치 variant는 AJ안으로 접근이 방지되는 반면, 사이즈가 작은 노치 variants들은 AJ와 colocalize한다는 것을 확인한 이미지. (d) 크기가 작은 노치는 AJ 안으로 접근이 가능해 RIP 도메인에 축적된 γ-secretase와 상호작용을 통하여 S3에서 분해되어 ICD를 만들어 활성화됨을 보여주는 Western Blot 분석 결과.  

3. AJ 기반 미세 구획화에 의한 신경줄기세포 분화 및 신경계 발생 과정 조절
 대뇌 피질의 Notch 신호는 신경세포 생성을 조절한다. Notch 신호는 수평적으로 증식하는 세포와 방사형으로 분화하는 세포 사이의 균형을 맞추어, ventricular-zone (VZ) 지역의 신경줄기세포 (Neural Progenitor Cell, NPC)의 확장과 분화를 조절하여 신경세포 조직의 organization을 형성한다. 선행 연구를 통하여 대뇌 피질의 AJ가 Notch 신호 및 NPC 발달 과정에 중요한 역할을 함이 추론되고 있다 (10). 우리는 발달 중인 mouse brain의 AJ에서 Notch는 배제되고 γ-secretase은 축적되어 있음을 확인하여 in vivo 발달 과정의 대뇌에서도 AJ가 멤브레인을 두개의 구획으로 구분한다는 사실을 발견하였다 (그림 5a,b). VZ-NPC의 분화 및 발달과정에서의 AJ의 기능을 확인하기 위해, 우리는 세포외벽 도메인이 truncation된 돌연변이 cadherin을 발현시킴으로써 AJ 형성을 방지하고 RIP 도메인의 형성을 막았다 (그림 5c). 발달 중인 생쥐 뇌의 신경줄기세포에 돌연변이 cadherin 발현시켰을 때 AJ 불안정화는 VZ 구역에서 줄기세포들의 비정상적으로 빠른 신경세포로의 분화를 촉진하였으며, 이는 접착연접에 의한 미세 구획화 메커니즘과 Notch 신호 제어 과정이 VZ-NPC 유지를 통한 신경계 발달과정에 중요한 역할을 함을 시사한다 (그림 5d). 



그림 5. 발달 중인 생쥐 뇌에서도 AJ를 통한 LRE 및 RIP 세포막 구획화가 노치 신호 조절한다. (a-b) 생쥐 뇌의 VZ 지역에서 Ncad와 Notch가 서로 공간적으로 분리되어 있음을 확인. (c-d) γ-secretase는 N-cad에 의한 AJ에 공존하고 축적됨을 확인. (a,c) x-y maximum projection 및 line profile 분석, (b,d) z reslice 이미지. (e) 돌연변이 및 정상 cadherin을 발현시켜 발달 중인 생쥐 뇌에서 AJ 형성을 방지하는 schematics. (f)돌연변이 cadherin를 발현시켜 AJ 구조 형성을 억제할 경우, NPCs가 신경세포(neuron)으로 비정상적으로 빠르게 분화하는 것을 확인함. 


연구의 성과 및 의의
 본 연구는 노치 신호 활성화 및 아밀로이드 베타 형성에 필요한 단백질의 순차적 절단 과정의 새로운 분자-세포학적 메커니즘을 최초로 제시했다. 특히 Notch 신호가 AJ에 의한 세포막 구획화라는 추가적인 ‘공간적 스위치’ 를 도입하여 매우 정교하게 조절되어야 하는 신호 활성화 및 유전자 발현 조절에 크리티컬한 과정인 단백질 cleavage 시퀀스를 매우 타이트하게 조절함을 규명했다. 선행 연구에서 제시되었던 Notch와 γ-secretase 사이 화학적 인터페이스의 변화에 의한 proteolysis 진행 여부가 결정된다는 모델은 여전히 유효하지만 (11), 본 연구를 통하여 접착연접 구조에 의한 미세 구획화 현상은 Notch와 γ-secretase가 같은 공간에 있는 것을 방지함으로써 두 분자의 상호 작용 조절을 위한 더욱 확실한 스위치 기전임을 밝혀냈다. 
 또한 우리의 in vivo 실험 결과를 통하여 세포의 환경 변화에 따른 공간적 (spatial), 물리적 (physical) 변화는 세포 신호를 조절하여 줄기 세포의 유지 및 분화 여부를 결정하고 이는 시공간적으로 조절된 조직의 발달과정으로 이어진다. 이번 연구는 향후 비정상적인 세포 신호 전달에 의한 암 관련 연구 및 치료제 개발에 기여할 수 있을 것으로 기대되며, 합성 생물학과 Notch 신호 체계를 융합하여 줄기 세포 및 면역 세포의 유전자 발현과 기능을 조절하는 합성-노치 수용체가 더욱 정밀하게 제어가 되고 활성화되었을 때 더 큰 효과를 내도록 디자인하고, Notch 신호를 조절하여 신경계 발달과정을 보다 정확하게 모사하는 브레인 오가노이드 개발 기술로 연구를 확장하고자 한다.  

참고문헌
1. Manz, B. N. & Groves, J. T. Spatial organization and signal transduction at intercellular junctions. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 342–352 (2010).
2. Kopan, R. & Ilagan, M. X. G. The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism. Cell 137, 216–233 (2009).
3. van Es, J. H. et al. Notch/γ-secretase inhibition turns proliferative cells in intestinal crypts and adenomas into goblet cells. Nature 435, 959–963 (2005).
4. South, A. P., Cho, R. J. & Aster, J. C. The double-edged sword of Notch signaling in cancer. Semin. Cell Dev. Biol. 23, 458–464 (2012).
5. Kovall, R. A., Gebelein, B., Sprinzak, D. & Kopan, R. The canonical Notch signaling pathway: structural and biochemical insights into shape, sugar, and force. Dev. Cell 41, 228–241 (2017).
6. Bray, S. J. Notch signalling: a simple pathway becomes complex. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 678–689 (2006).
7. Honig, B. & Shapiro, L. Adhesion protein structure, molecular affinities, and principles of cell–cell recognition. Cell 181, 520–535 (2020).
8. Lee, S.-J. et al. A detergent-insoluble membrance compartment contains Aβ in vivo. Nat. Med. 4, 730–734 (1998).
9. Kwak, M. et al. Small, clickable, and monovalent magnetofluorescent nanoparticles enable mechanogenetic regulation of receptors in a crowded live-cell microenvironment. Nano Lett. 19, 3761–3769 (2019).
10. Hatakeyama, J. et al. Cadherin-based adhesions in the apical endfoot are required for active Notch signaling to control neurogenesis in vertebrates. Development 141, 1671–1682 (2014).
11. Shah, S. et al. Nicastrin functions as a γ-secretase-substrate receptor. Cell 122, 435–447 (2005).

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