생화학분자생물학회

Molecular Neurocircuits Lab

이은정

아주대학교 의과대학 뇌과학과

[연구실 소개]

본 연구실은 2021년부터 아주대 의과대학에 자리잡은 신생 연구실입니다. 1년 정도 밖에 되지 않았지만, 생쥐모델 전문 신경과학자인 이은정 교수와 뇌염증 기작 (박수정 박사) 및 예쁜꼬마선충 연구 (신민기 박사)에 대한 전문성 있는 2인의 박사후연구원이 이끌고 있어 뇌기능과 뇌질환에 대한 넓은 스펙트럼의 연구가 가능한 실험실로 성장하고 있습니다.

본 실험실의 연구 내용의 한 축은 스트레스와 같이 항상성 유지에 필요한 뇌기능과 연관된 뇌회로를 분자적 수준에서 탐구하는 것입니다. 예를 들어, 스트레스를 받게 되면 어떠한 뇌세포가 활성화되고, 이 활성화된 세포가 어떠한 세포에 신호를 전달하는지는, 뇌영역 수준에서는 수십년간 연구가 되어 왔지만 여전히 세포 수준 및 분자 수준의 연구는 미흡한 편입니다. 본 연구실에서는 세포간 연결을 표지할 수 있는 바이러스 추적자 (virus tracer)와 단일 세포의 분자적 특성을 살펴볼 수 있는 single cell RNA-seq 기술을 접목하여 특정 뇌기능에 필요한 세포 타입을 규명하고 이들이 서로 어떻게 연결되어 있는지 연구하고 있습니다.

또 다른 한 축은 대표적인 퇴행성 뇌질환인 파킨슨병의 발병 기전을 분자적, 뇌회로적, 면역학적 관점 및 장뇌축 (gut-to-brain axis) 측면에서 연구하여 새로운 치료 방법을 모색하는 것입니다. 파킨슨병은 중뇌의 도파민 신경세포가 선택적으로 사멸되는 퇴행성 뇌질환으로써, 삶의 질을 저해할 수 있는 인지 및 행동 장애 등이 유발되기 때문에 고령화 시대에 돌입한 현대 사회에서 그 치료와 예방에 대한 관심이 높은 질환입니다. 따라서 파킨슨병에 대한 연구는 꾸준히 지속되고 있지만 여전히 근본적인 치료제 및 예방책은 없는 실정이기 때문에 새로운 접근이 필요하다고 생각합니다. 따라서 장 (gut)과 같은 말초 기관에도 infection 가능한 virus tracer와 single cell RNA-seq과 같은 최신 연구방법을 파킨슨병 연구에 도입하였습니다. 또한 파킨슨병 환자들의 바이오마커 단백질인 알파시누클레인 (alpha-synuclein, αSyn)의 축적이 장에서 먼저 시작되어 뇌까지 도달할 수 있다는 가설이 최근 과학적으로 증명되고 있지만, 어떠한 인자가 장내 αSyn의 축적을 유도하는지는 전혀 알려져 있지 않습니다. 따라서 본 연구실은 αSyn의 장내 축적 인자를 장 세균 유전자의 관점에서도 살펴보고 있습니다.

[연구내용]

1. 뇌기능 조절 뇌회로 규명

1) Virus-assisted single cell RNA-seq을 통한 분자 수준의 뇌회로 규명

Receptor-Assisted Molecular mapping of Upstream Neurons (RAMUN)

시상하부에 위치한 corticotropin releasing hormone (CRH) 신경 세포는 스트레스 호르몬의 분비를 조절하는 것으로 잘 알려져 있지만, 어떻게 다양한 스트레스와 위험 신호들이 모아져서 CRH 신경 세포에 전달되는지에 대해서는 여전히 잘 알려져 있지 않았습니다. 이에 대한 연구를 위해서 이은정 교수는 기존에 Receptor-Assisted Molecular mapping of Upstream Neurons (RAMUN) 방법을 고안하였습니다. RAMUN은 하위 신경 세포에 발현하는 수용체를 단일 세포 수준에서의 전사체 분석 방법 (single cell RNA sequencing, scRNA-seq)으로 살펴본 뒤, 그 리간드 (ligand)를 발현하는 상위 신경 세포를 retrograde viral tracer (Pseudorabies virus, PRV)로 조사하는 방법입니다. 이 방법을 CRH 신경 세포에 적용하여, 기존에 식욕 억제 기능을 담당하는 것으로 알려진 POMC (proopiomelanocortin) 신경 세포가 CRH 신경 세포의 상위 세포라는 것을 관찰하였습니다. 또한 실제로 POMC 신경 세포가 특정한 정서적 스트레스에 의해 분비되는 호르몬을 조절할 수 있다는 것을 발견하였습니다. 이는 기존에 식욕 억제의 기능에만 초점이 맞춰져 있던 POMC 신경 세포의 또 다른 기능을 밝혀 관련 연구의 새로운 방향을 제시하였다는 데에 큰 의의가 있습니다 (Lee et al, 2020, Sci Adv). 이러한 RAMUN 방법을 이용하여 스트레스 뿐만 아니라 식욕, 보상, 감각, 정서 등 다양한 뇌기능 조절에 관여하는 뇌회로를 분자적인 수준에서 연구하고자 합니다.

Connect-seq

최근 single cell RNA-sequencing (scRNA-seq) 기술의 발전에 힘입어 단일 신경 세포의 전사체를 규명하는 연구들이 활발히 진행되고 있으나 각각의 신경 세포가 어떻게 서로 연결되어 있는지는 알려져 있지 않았습니다. 따라서 scRNA-seq 방법을 retrograde viral tracing과 결합하여 특정 회로의 상위 신경 세포를 분자적으로 규명할 수 있는 방법인 “Connect-seq”을 고안하였습니다. Rabies virus를 활용한 scRNA-seq이 여러 그룹에서 시도되었지만 충분한 sequencing 깊이를 얻어내는 데에 실패한 반면, 이은정 교수는 pseudorabies virus (PRV)를 이용하여 단일 세포 당 ∼6.5 million reads를 얻어내는 데에 성공한 바 있습니다. Connect-seq의 활용성을 증명하기 위하여, 본 연구실에서는 Connect-seq을 이용하여 스트레스 호르몬 분비에 필수적인 CRH 신경 세포의 상위 신경 세포에서 발현하는 신경 전달 물질을 조사하였습니다. 그 결과, 활성 및 억제성 신경 전달 물질의 마커 유전자들이 모두 CRH 신경 세포의 상위 신경 세포에서 발현하는 것을 발견하였습니다. 또한 도파민과 같은 아민 (amine) 계열 신경 전달 물질 뿐만 아니라 다양한 신경 펩타이드(neuropeptide)가 CRH 신경 세포의 상위 세포에서 발현하는 것을 알 수 있었습니다. 이러한 결과는 CRH 신경 세포가 매우 다양한 신경 전달 물질에 의해 조절된다는 것을 시사합니다. 또한 신경 펩타이드는 특정 뇌영역에 위치한 상위 세포에서만 특이적으로 발현하는 것을 관찰함으로써, Connect-seq 방법이 특정 세포에 물리적으로 연결되어 있는 상위 세포들의 위치와 분자적 마커 분석을 통해 해부학적-분자적 뇌지도 확립에 적용될 수 있다는 것을 보고하였습니다 (Hanchate & Lee et al, 2020, PNAS). 따라서 Connect-seq 방법이 매우 복잡한 뇌신경 회로에서 서로 연결되어 있는 다양한 세포 종류의 기능을 연구하는데 있어 매우 중요한 툴로 활용될 수 있기 때문에, Connect-seq을 활용하여 다양한 뇌기능 및 뇌질환을 연구하고 있습니다.

2) 후각 관련 뇌회로 규명

이은정 교수는 후각 수용체를 최초로 동정한 공로로 2004년 노벨생리의학상을 수상하신 Linda Buck 선생님 실험실에서 박사후연구원으로 일하면서 후각에 대해 많은 관심을 가져왔습니다. 위에서 설명한 virus-assisted single cell RNA-seq 등의 방법을 통해 CRHNs의 상위 세포가 위치한 뇌영역 중에 다양한 스트레스에 의해 공통적으로 활성되는 영역 (B; BNSTa, anterior part of bed nucleus of stria terminalis)과 각각 다른 스트레스에 의해 활성화되는 영역이 있다는 것을 보고한 뒤 (Lee et al, 2020, Sci Adv), 흥미롭게도 장미향의 주성분인 2-phenylethanol가 CRHNs의 상위 BNSTa 세포의 스트레스에 의한 활성을 억제하여 스트레스 호르몬 분비를 감소시킬 수 있다는 것을 관찰하였습니다. 또한 2PE는 CRHNs를 VMH (ventromedial hypothalamus)라는 영역의 억제성 신경 세포인 GABAergic neurons을 활성시킴으로써 직접적으로 억제한다는 것도 알 수 있었습니다 (Lee et al, 2021, bioRxiv). 이렇게 후각에 의한 스트레스 억제 등 후각에 의한 생리 현상 조절 기작을 분자적, 뇌회로적 관점에서 연구하고 있습니다.

2. 파킨슨병의 발병 기전을 분자적, 뇌회로적, 면역학적 관점 및 장뇌축 (gut-to-brain axis) 측면에서 연구

1) Virus-assisted single cell RNA-seq을 통한 분자 수준의 gut-to-brain 회로 규명

장에서 알파시누클레인 (α-Synuclein, αSyn)의 축적이 파킨슨병 (Parkinson’s disease, PD)의 원인이 될 수 있다는 사실이 보고되었지만, αSyn의 장내 축적의 원인은 전혀 알려져 있지 않습니다. 말초 기관에도 infection 될 수 있는 PRV의 성질에 기반하여 PRV를 위장에 주입하고 그 상위에 위치하는 도파민 신경세포의 분자적 특징을 단일 세포 수준에서 분석할 예정입니다. 이를 통하여 위장으로부터 αSyn 단백질을 다수의 시냅스를 거쳐 전달받는 도파민 신경세포의 분자적 마커를 발굴하여 SNc 도파민 신경세포에 αSyn의 축적을 억제할 수 있는 새로운 치료 대상을 제안할 수 있을 것으로 기대하고 있습니다.

2) Microbiome에 의한 PD 발병 조절

PD 환자의 장내 세균 군집이 변화되어 있다는 등의 보고에 의해 장 세균 군집과 PD의 연관성에 대해서는 연구가 진행되고 있는 추세이지만, 특정 장 세균 유전자와 PD 발병 간의 상호 작용에 대한 연구는 전무한 실정입니다. 본 연구진은 “PD의 주요 바이오마커인 αSyn 안정성을 조절하는 장 세균 유전자에 의해 αSyn의 장내 축적이 조절될 수 있다”는 가설 증명을 위한 연구를 수행하고 있습니다. 이 가설을 검증하기 위해 단일 유전자 결손 대장균 라이브러리와 대장균을 식이하는 예쁜꼬마선충 모델을 활용하여 αSyn 안정성을 조절하는 세균 유전자를 규명할 계획입니다.

3) 뇌염증 관련 유전자 결손 생쥐 모델 통한 PD 관련 면역 체계 이해

바이러스 감염, 미토콘드리아 손상 등에 의한 세포내 dsDNA의 증가는 STING (Stimulator of interferon genes)이 활성화되어 염증 반응이 유도되는 것이 잘 알려져 있습니다. 이러한 STING의 활성 파트너 중에 하나인 STAT6는 전사 인자로서 항바이러스 케모카인 (예. Ccl2) 발현을 증가시킴으로써 염증과 같은 선천적 면역 반응을 매개한다는 것 또한 알려졌습니다 (Chen et al, 2011, Cell). 유전적 파킨슨병의 대표적인 유전자인 PINK1이나 Parkin 유전자 결손 생쥐는 파킨슨병 증상이 나타나지 않는데, 흥미롭게도 이들 쥐에서 미토콘드리아 손상을 유도하면 파킨슨병 유사 증상이 나타나고, STING을 없앴더니 이러한 파킨슨병 유사 증상이 사라지는 것이 보고된 바있습니다 (Sliter et al, 2018, Nature). 즉, 손상된 미토콘드리아에서 유출된 dsDNA에 의한 STING의 활성에 의한 염증 반응이 도파민 신경세포의 사멸을 유도하여 파킨슨병이 유도할 수 있다는 가설을 뒷받침하고 있습니다. 그러나 여전히 어떻게 STING의 활성이 도파민 신경세포 선택적으로 일어날 수 있는지, STAT6의 역할은 무엇인지 등등 아직 풀리지 않은 궁금증들은 많이 남아 있습니다. 이러한 질문에 답을 하고자 본 연구실에는 STING KO, STAT6 KO, PINK1::STAT6 KO 등을 보유하고 있으며, 위에서 언급된 tool들을 활용하여 뇌염증과 파킨슨병의 상관관계에 대한 연구를 할 계획입니다. 

[연구책임자]

이은정 교수

소속: 아주대학교 의과대학 뇌과학과

전화: 031-219-4529, 010-7645-3128

Email: elee@ajou.ac.kr

Homepage: https://sites.google.com/ajou.ac.kr/elee

[연구진 구성]

책임교수: 이은정

연구교수: 박수정

박사후연구원: 신민기

학부생: 임우택, 장연주, 윤서연, 허정민

[대표논문]

Lee EJ, Saraiva L, Hanchate NK, Ye X, Asher G, Ho J, Buck LB (2021) Odor blocking of stress. bioRxiv (https://doi.org/10.1101/2021.02.24.432809)

Lee EJ, Hanchate NK, Kondoh K, Tong APS, Kuang D, Spray A, Ye X, Buck LB (2020) A psychological stressor conveyed by appetite-linked neurons. Sci Adv 6, eaay5366 

Hanchate NK*, Lee EJ*, Ellis A, Kondoh K, Kuang D, Basom R, Trapnell C, Buck LB (2020) Connect-seq to superimpose molecular on anatomical neural circuit maps. Proc Natl Acad Sci U S A 117, 4375  (* Equal contribution)

Yun S, Lee EJ, Choe HK, Son GH, Kim K, Chung S (2020) Programming effects of maternal stress on the circadian systems of adult offspring. Exp Mol Med 52, 473 

Chung S, Lee EJ, Cha HK, Kim J, Kim D, Son GH, Kim K (2017) Cooperative roles of the suprachiasmatic nucleus central clock and the adrenal clock in controlling circadian glucocorticoid rhythm. Sci Rep 7, 46404

Chung S, Lee EJ, Yun S, Choe HK, Park SB, Son HJ, Kim KS, Dluzen DE, Lee I, Hwang O, Son GH, Kim K (2014) Impact of circadian nuclear receptor REV-ERBa on midbrain dopamine production and mood regulation. Cell 157, 858 

Lee EJ, Son GH, Chung S, Lee S, Kim J, Choi S, Kim K (2011) Impairment of fear memory consolidation in maternally stressed male mouse offspring: evidence for nongenomic glucocorticoid action on the amygdala. J Neurosci 31, 7131