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등온핵산증폭 (Isothermal nucleic acid amplification)

  • 작성자

    박현규 (KAIST 생명화학공학과)
  • 작성일자

    2022-03-12
  • 조회수

    6276

등온핵산증폭 (Isothermal nucleic acid amplification) 

 



박현규

한국과학기술원 생명화학공학과

(hgpark@kaist.ac.kr​)  

 

1. 서론

1983년, Kary Mullis 등에 의해 개발된 중합효소연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction: PCR)은 고온에서도 활성을 유지하는 DNA 중합효소를 이용하여 아주 적은 양의 유전자를 지수함수적으로 증폭할 수 있는 핵산증폭 기술이다. 일반적인 PCR은 변성 (Denaturation at 95℃), 접합 (Annealing at 55℃), 그리고 신장 (Extension at 72℃)의 세 단계로 이루어진 증폭 과정을 20-40회 가량 반복함으로써 표적 유전자를 증폭한다. 표적 유전자를 분석 가능한 양으로 증폭할 수 있기 때문에, 바이러스를 포함한 각종 병원균의 감염 진단, 유전자 염기서열 분석, 유전병 진단, 돌연변이 분석 등 다양한 분야에 널리 사용되고 있다.(1) 최종 (End-point) 산물을 전기영동을 통해서 확인하던 초기의 PCR 기술은, 1992년 증폭되는 산물을 통해서 발생하는 형광 신호를 실시간으로 검출하는 실시간 유전자 증폭 검사법 (real-time PCR: RT-PCR)으로 발전되었으며(2), 2019년 12월 중국에서 최초로 발생하여 현재 전 세계적으로 팬데믹 (Pandemic)을 일으키고 있는 코로나바이러스 감염증 (COVID-19)을 검출하기 위한 표준 분자진단 방법으로 사용되고 있다. 이러한 PCR 기반 분자진단 기술은, 온도 변환을 위해서 고가의 정교한 온도조절 장치 (Thermal cycler)가 필요하고, 또한 열변성/접합/신장의 세 단계로 구성되어 있기 때문에 비교적 진단 시간이 길게 소요된다는 단점을 가지고 있다.

이러한 온도 변환 과정이 필요 없이 동일한 온도 조건에서 핵산을 증폭할 수 있는 등온핵산증폭 기술이, 1991년 Nucleic Acid Sequence-Based Amplification (NASBA) 기술 개발을 시작으로 활발히 연구되고 개발되었다. 본 글에서는 대표적인 등온핵산증폭 기술을 소개하고, 특히 최근 COVID-19 진단을 위해서 유전자가위 기술과 결합된 형태로 개발된 등온핵산증폭 기술들에 대해서 알아보고자 한다. 또한, 본 연구 그룹에서 개발한 독자적인 원천 등온핵산증폭 기술도 소개하고자 한다.

 

2. 본론

 2-1. 기존 등온핵산증폭 기술

최초로 개발된 등온증폭 기술인 NASBA 기술과 최근 COVID-19 분자진단을 위해 유전자가위 시스템에 접목된 형태로 활용되고 있는 대표적인 등온증폭 기술인 Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP)와 Recombinase Polymerase Amplification (RPA) 기술에 대해 소개하고자 한다.  

  (1) Nucleic Acid Sequence-Based Amplification (NASBA)

NASBA 기술은, 표적 RNA를 등온증폭 시키는 최초의 등온핵산증폭 기술이다. 표적 RNA에 T7 프로모터를 포함하는 프라이머가 결합하고 역전사 효소 반응에 의해 신장된 후, 생성된 DNA/RNA 이중가닥에서 RNA 가닥이 RNase H에 의해 분해된다. 두 번째 프라이머 도입을 통해 T7 프로모터를 포함하는 DNA 이중가닥이 형성되면, T7 RNA 중합효소의 전사 반응에 의해 표적 RNA와 상보적인 염기서열을 갖는 anti-sense RNA 산물이 대량으로 생성된다. 생성된 anti-sense RNA에 두 번째 프라이머가 먼저 결합하여 신장되고 이어서 T7 프로모터를 포함하는 프라이머가 결합하여 신장됨으로써 T7 프로모터를 포함하는 DNA 이중가닥이 형성하고 똑같은 원리로 최종 anti-sense RNA를 생성함으로써 최종 산물의 증폭 효율을 더욱 높일 수 있다. 41℃ 단일온도 조건에서 2시간 이내에 표적 유전자를 109배 증폭할 수 있다.(3)

 

그림 1. NASBA 모식도 (4)

 

 

(2) Loop-mediated isothermal AMPlification assay (LAMP)

60~65℃ 범위 내 일정한 온도 조건에서 증폭 반응이 진행되는 LAMP 반응은, 일반적으로 2쌍의 프라이머를 사용하여 DNA 중합효소에 의해서 먼저 양쪽 말단이 모두 접힌 덤벨 (Dumbell) 형태의 단일가닥 DNA 산물이 만들어지게 된다. 이후, 덤벨의 양쪽 루프 (Loop) 영역은 한가닥이므로 프라이머가 결합하고 신장되며 덤벨 형태로 말린 3‘ 말단도 DNA 중합효소에 의해서 신장된다. DNA 합성 방향에 이미 있는 이중가닥 DNA가 해리되면서 중합이 진행되어 반복적인 stem-loop DNA 구조가 연속적으로 증폭된다. 이러한 증폭 특성으로 인해서, 최종 산물은 원래 표적 서열의 정수배의 서로 다른 길이의 이중가닥 DNA이다. 단일온도 조건에서 1시간 이내에 표적 유전자를 109배 증폭할 수 있다.(5)

 


그림 2. LAMP 모식도 (5)  

 

(3) Recombinase Polymerase Amplification (RPA)

37~42℃ 범위 내 일정한 온도 조건에서 증폭 반응이 진행되는 RPA 반응은 재조합 효소 (Recombinase) 단백질이 프라이머에 결합하여 복합체를 형성하며 시작된다. 재조합 효소/프라이머 복합체는 이중가닥 DNA 내 상보적인 서열을 찾아 결합하며, 삽입된 프라이머에 의해 분리된 DNA 가닥은 단일가닥 결합 단백질 (Single-strand binding protein: SSB)에 의해 안정화된다. 이후 재조합 효소가 분리되고, DNA 중합효소에 의해 프라이머의 DNA 합성이 시작되며, 20분 내의 짧은 반응 시간에 표적 유전자를 109~1011배 증폭할 수 있다.(6) 

 

그림 3. RPA 모식도 (7)

 

 2-2. 유전자가위 시스템과 접목된 등온핵산증폭 기술 기반 COVID-19 분자진단 기술

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein (Cas) 시스템 기반의 진단기술은, 핵산을 절단할 수 있는 Cas 단백질과 특정 표적 핵산을 인식하는 gRNA (guide RNA)로 구성된 복합체를 이용한다. CRISPR/Cas 시스템은 표적 핵산을 인식하여 표적 핵산을 절단할 뿐만 아니라 주변에 존재하는 리포터 프로브 (reporter probe) 또한 무작위적으로 절단하여 특정 신호를 발생시킨다. CRISPR/Cas 시스템을 구성하는 Cas 단백질의 종류에 따라 인식하고 절단하는 핵산의 종류가 다르다. 대표적인 예로 Cas12는 이중가닥 DNA를 인식하여 DNA 리포터 프로브를 절단하고, Cas13은 단일가닥 RNA를 인식하여 RNA 리포터 프로브를 절단하여 신호를 발생시킨다. 

표적에 따른 CRISPR/Cas 시스템의 높은 선택도와 민감도를 기반으로, 최근 LAMP 또는 RPA와 같은 등온핵산증폭 기술들과 CRISPR/Cas 시스템을 접목시킨 분자진단 기술들이 개발되고 있다. 이러한 기술들은, 일차적으로 등온핵산증폭을 통해서 핵산을 증폭시키고 증폭된 핵산을 CRISPR/Cas가 인식하여 주변의 리포터 프로브를 절단함으로써 신호를 생성하는 단계를 포함한다. 아토 몰 (aM) 수준의 매우 민감한 검출이 가능하며, 단일 염기 수준의 매우 특이적인 표적 유전자 검출이 가능하다는 장점을 갖는다.

 

(1) Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing (SHERLOCK)

2017년 개발된 SHERLOCK은 Cas13a이 표적 RNA와 결합했을 경우, 주변에 존재하는 리포터 RNA를 무작위적으로 절단하는 활성을 이용한다. 먼저 검출하고자 하는 표적 핵산을 등온핵산증폭 기술인 RPA 반응을 통해 증폭시킨 후, 이를 T7 RNA 중합효소에 의한 전사 반응을 이용하여 다량의 RNA 산물을 생성한다. 증폭된 표적 RNA는 CRISPR/Cas13a 시스템에 의해 인식되며, 주변에 존재하는 RNA 리포터 프로브를 무작위적으로 절단하여 증폭된 형광 신호를 나타내게 된다.(8)

 

(2) DNA Endonuclease-TargEted CRISPR Trans Reporter (DETECTR)

2018년 개발된 DETECTR는 Cas12a가 표적 DNA와 결합했을 경우, 주변에 존재하는 리포터 DNA를 무작위로 절단하는 활성을 이용한다. SHERLOCK과 동일하게 RPA 반응을 통해 표적 핵산을 증폭시키며, 증폭 산물인 이중가닥 DNA가 CRISPR/Cas12a 시스템에 의해서 인식되며, 주변에 존재하는 DNA 리포터 프로브를 무작위적으로 절단하여 증폭된 형광 신호를 나타내게 된다.(9) RNA 증폭산물을 인식하는 SHERLOCK와 달리 이중가닥 DNA 증폭산물을 인식하기 때문에 RPA 등온증폭 반응 이후에 추가적인 전사 반응을 할 필요가 없다는 점이 SHEROCK에 비해서 장점이다.

 

그림 4. SHERLOCK과 DETECTR 모식도 (8, 9)

 

 

 2-3. 본 연구팀에서 개발한 새로운 등온핵산증폭 기술

본 연구팀에서는 종래의 기술들이 갖는 문제점을 해결함과 동시에 새롭고 다양한 원천기술들을 확보하고자, 지속적으로 새로운 형태의 등온핵산증폭 기술을 개발하는 연구를 수행하고 있다. 이글에서는 기존 등온핵산증폭 기술인 NASBA의 민감도를 크게 향상시킨 Nicking/Extension chain reaction System-Based isothermal nucleic acid Amplification (NESBA) 기술과 새로운 원리의 등온핵산증폭 기술인 Self-Priming Hairpin-mediated isothermal AMPlification (SP-HAMP) 기술에 대하여 소개하고자 한다.

 

(1) Nicking/Extension chain reaction System-Based isothermal nucleic acid Amplification (NESBA)

기존 NASBA 기술은 표적 RNA로부터 T7 프로모터를 포함하는 이중가닥 DNA를 충분히 생성하지 못하기 때문에 결과적으로 최종 anti-sense RNA가 충분히 증폭되지 못하여 위음성 (false negative) 결과를 야기할 수 있다. 본 연구팀은 상기 문제점을 해결하기 위해, 기존 NASBA 기술에 절단 효소 인식 염기서열이 수식된 프라이머를 도입하고 절단 효소와 DNA 중합효소의 연쇄 반응을 이용하여, T7 프로모터를 포함하는 이중가닥 DNA의 지수함수적 증폭 반응을 구현함으로써, 기존 NASBA 기술 대비 높은 증폭 효율을 보이는 신개념 등온핵산증폭 기술 (NESBA)을 개발했다.(10) 

그 결과, 최종 산물인 anti-sense RNA 생산 효율을 크게 증대시켜 기존 NASBA 기술 대비 약 100배 이상 향상된 민감도를 구현하였으며, 이를 SARS-CoV-2 유전자 검출에 적용하여 30분 내에 0.5 copies/μL 수준의 고감도로 바이러스 핵산을 검출하는데 성공하였다. 추가로 서울 세브란스병원을 통해 임상 검체를 제공받아 임상 실험을 진행한 결과, COVID-19 환자 시료 30개와 정상 시료 68개를 모두 정확하게 진단하여 100% 임상 민감도와 100% 임상 특이도를 달성하였다. 기술비교를 위해서, 현재 국내 COVID-19 검출에 대표적으로 사용되는 Seegen사의 allplexTM 2019-nCoV assay kit를 이용하여 동일 임상 샘플들에 대한 실험을 진행하였다. 그 결과, 정상 시료는 모두 정확하게 음성으로 분석되었으나, 1개의 환자 시료에서는 위음성 결과가 나왔다. 이러한 임상 테스트 결과는, 본 연구팀이 개발한 NESBA 기술의 높은 기술 완성도와 임상 유용성을 입증한다고 판단된다.(11)

 

그림 5. NESBA 모식도 (11)

 

 

그림 6. NESBA 기술을 이용한 COVID-19 임상 실험 결과 (11)

 

(2) Self-Priming Hairpin-mediated isothermal AMPlification (SP-HAMP)

기존 PCR 기술의 온도 변환에 의한 변성 과정을 대체하기 위해서, 대부분의 등온핵산증폭 기술들은 여러 쌍의 프라이머/프로브 혹은 여러 종류의 효소/단백질을 사용해야 하는 단점이 있다. 본 연구팀은 상기 문제점을 해결하기 위해, 단일 프로브 및 단일 효소만으로도 등온증폭을 구현할 수 있는 획기적인 등온핵산증폭 원천기술을 개발하였다.

본 기술에서는, 표적 핵산이 단일 헤어핀 프로브와 결합함으로써 3‘ 말단에 자가 접힘 구조를 형성하고 DNA 중합효소의 작용을 통해 긴 헤어핀 중합체 산물을 형성하게 된다. DNA 합성 과정 중에 결합한 표적 핵산은 유리되어 새로운 헤어핀 프로브와 결합하는데 사용된다. 생성된 중간체 산물의 5’ 말단 부위의 두 부분에 존재하는 포스포로티오에이트 (Phosphorothioate: PS) DNA 수식은 이중가닥 DNA의 결합력을 약하게 하여 3‘ 말단의 자가 접힘 구조를 야기하고 DNA 중합반응이 진행된다. 더욱 길어진 헤어핀 중합체 산물 또한 5’ 말단의 같은 위치가 PS-DNA로 수식되었기 때문에 같은 원리로 3‘말단이 자가 접힘 구조를 형성하고 DNA 중합반응이 진행되는 절차가 반복된다. 최종적으로 형성된 긴 길이의 헤어핀 이중가닥 DNA 중합체는 이중가닥 특이적 신호 물질을 이용하여 최종적으로 검출될 수 있다. 본 기술은, 단일 헤어핀 프로브와 단일 DNA 중합효소만을 이용하여 등온핵산증폭 반응을 구현한 유일한 기술이라고 판단된다.(12)

 

그림 7. SP-HAMP 모식도 (12)

 

 

 

3. 결론

 

등온핵산증폭 기술은 별도의 온도조절 장치 없이 동일한 온도 조건에서 빠르게 표적 유전물질을 증폭할 수 있는 장점을 가지고 있다. 이러한 장점들 때문에, 핵산뿐 아니라 단백질, 세포, 이온 등을 검출하는  바이오센서를 비롯하여, 바이오이미징 (Bioimaging), 시퀀싱 (Sequencing), 약물 전달 등 매우 다양한 영역에서 활발히 이용되고 있다. 특히, 최근 COVID-19의 대유행으로 인해서 현장에서 신속하게 분자 진단을 수행해야 하는 요구가 높아짐에 따라 등온핵산증폭 기술에 대한 관심이 크게 증가하였으며 실제로 NASBA, LAMP, RPA 등의 등온증폭 기술들이 COVID-19 진단에 폭넓게 적용되고 있다. 하지만, 현재까지 개발된 등온증폭 기술들의 증폭 효율이 아직은 기존의 PCR 기술에 비해서 낮다는 것은 해결해야 할 과제로 남아 있다. 또한 대부분의 등온증폭 기술들은 여러 쌍의 프라이머/프로브 또는 여러 종류의 효소/단백질을 요구한다는 점도 기존의 PCR 기술에 비해서 단점으로 평가된다. 따라서 매우 간단한 반응 기작을 통해서도 등온 조건 하에서 기존의 PCR 방법과 대등한 증폭 효율을 구현할 수 있는 새로운 등온증폭 기술이 지속적으로 개발되어야 할 것이다. 이러한 새로운 등온증폭 기술들은, 현장 분자진단 구현에 핵심적인 역할을 하여 향후 전문가의 도움 없이 개개인이 스스로 가정에서도 분자진단을 할 수 있는 시기를 크게 앞당길 것이다.

 

4. 참고문헌

1. Saiki R K, Scharf S, Faloona F, Mullis K B, Horn G T, Erlich H A, and Arnheim N (1985) Enzymatic amplification of β-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230(4732), 1350-1354

2. Higuchi R, Dollinger G, Walsh PS, and Griffith R (1992) Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Nat. Biotechnol. 10(4), 413-417

3. Compton J (1991) Nucleic acid sequence-based amplification. Nature 350, 91-92

4. Zanoli LM and Spoto G (2013) Isothermal amplification methods for the detection of nucleic acids in microfluidic devices. Biosensors 3(1), 18-43

5. Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, and Hase T (2000)  Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28(12), e63-e63

6. Piepenburg O, Williams CH., Stemple DL, and Armes NA (2006) DNA detection using recombination proteins. PLoS biology. 4(7), 1115-1121

7. Boyle DS, McNerney R, Teng Low H, Leader BT, Pérez-Osorio AC, Meyer JC, O Sullivan DM, Brooks DG, Piepenburg O, and Forrest MS (2014) Rapid detection of Mycobacterium tuberculosis by recombinase polymerase amplification. PLoS One 9, e103091

8. Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Lee JW, Essletzbichler P, Dy AJ, Joung J, Verdine V, Donghia N, Daringer NM, Freije CA, Myhrvold C, Bhattacharyya RP, Livny J, Regev A, Koonin EV, Hung DT, Sabeti PC, Collins JJ, and Zhang F (2017) Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2/c2. Science 356(6336), 438-442

9. Chen JS, Ma E, Harrington LB, Da Costa M, Tian X, Palefsky JM, and Doudna JA (2018) CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science 360(6387), 436-439 

10. Ju Y, Kim HY, Ahn JK, and Park HG (2021) Ultrasensitive version of nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) utilizing a nicking and extension chain reaction system. Nanoscale, 13(24), 10785-10791

11. Ju Y, Kim J, Park Y, Lee CY, Kim K, Hong KH, Lee H, Yong D, and Park HG (2022) Rapid and accurate clinical testing for COVID-19 by nicking and extension chain reaction system-based amplification (NESBA). Biosens. and Bioelectron. 196, 113689

12. Song J, Kim HY, Kim S, Jung Y and Park HG (2021) Self-priming phosphorothioated hairpin-mediated isothermal amplification. Biosens. Bioelectron 178, 113051

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