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우수논문소개

숙주의 tp53돌연변이에 의한 시알산 대사의 변화로 장내미생물총의 불균형과 장염증이 증가하는 기전규명

  • 작성자

    이정수 외 3인 (한국생명공학연구원)
  • 작성일자

    2022-11-07
  • 조회수

    2415

숙주의 tp53돌연변이에 의한 시알산 대사의 변화로 장내미생물총의 불균형과 장염증이 증가하는 기전규명 

Host tp53 mutation induces gut dysbiosis eliciting inflammation through disturbed sialic acid metabolism Microbiome, 10:3, 2022 

          


이재근 (한국생명공학연구원 마이크로바이옴융합연구센터 박사후 연구원, jglee89@kribb.re.kr)
이수현 (한국생명공학연구원 감염병연구센터 연구원, ysh76@kribb.re.kr)
류충민 (한국생명공학연구원 감염병연구센터 책임연구원, cmryu@kribb.re.kr)
이정수 (한국생명공학연구원 마이크로바이옴융합연구센터 책임연구원, jeongsoo@kribb.re.kr)


연구배경

 지속적이고 낮은 수준의 염증 상태를 유지하는 만성 염증(chronic inflammation)은 자가 면역 반응, 감염, 대사 기능 장애 및 환경 오염 물질로 인해 발생하며, 이로 인해 인간은 여러 기관에서 다양한 유형의 암에 걸리기 쉽다. 특히, 대장염과 같은 대장의 만성 염증은 장의 이형성증을 동반하고 궁극적으로 염증성 대장암(colitis-associated colorectal cancer, CAC)을 촉진하는 것으로 잘 알려져 있다 [1, 2]. 염증성 대장암은 사이토카인/케모카인의 증가된 발현, 비정상적인 면역 세포 침윤, 그리고 DNA 및 단백질을 손상시키는 활성산소종(ROS) 상승으로 종양 형성을 유발하는 변경된 미세환경에 의해 촉진되며, 이 과정에서 상피 세포와 면역 세포의 NF-κB 신호 전달은 만성 염증과 암 발생의 핵심적인 연결고리이다 [3]. 

일련의 유전자 분석을 통해 대장암의 발병 기간 동안 APC, K-RAS 및 TP53을 포함한 종양 억제 유전자 및 종양 유전자의 여러 돌연변이가 확인되었다 (그림 1). 그 중에서도 TP53(p53 단백질의 유전자명) 종양 억제자의 손실 또는 돌연변이는 CAC에서 종양 형성의 초기 단계에서 자주 발견되는, 숙주의 가장 중요한 CAC 발병 개시의 핵심인자이다. 이러한 초기 TP53 돌연변이는 CAC 진행과정에서 NF-κB 의존성 만성 염증의 유도를 유발하고 염증성 미세 환경과 관련된 장 상피 세포의 완전성을 손상시키며, 또한 염증 유발과정에서 TP53과 NF-κB은 길항적으로 상호 작용하며 TP53 기능 향상에 의한 NF-κB 신호가 증가됨이 잘 알려져 있다[4, 5].


그림 1. 대장염 관련 대장암 및 산발성 대장암 발병과정 중 위험유전인자의 돌연변이 흐름도. Itzkowitz 와 Harpaz [6]에서 변형

장염증과 대장암 모두에 관련된 또 다른 중요한 요소는 대장 내 서식하는 장내 미생물균총(gut microbiota)이다[7]. 장내 미생물균총은 생리적 조건 하에서 숙주의 발달, 대사 및 면역에 필수적인 역할을 할 뿐만 아니라 장내 미생물균총의 불균형(dysbiosis)으로 알려진 미생물의 공생이 파괴는 다양한 염증성, 대사성 및 신경계 질환과 밀접한 관련성을 지닌다[8, 9]. 특히, 이러한 장내 미생물균총의 불균형은 숙주 미세환경을 변화시키고 염증 반응을 유도함으로써 대장암를 촉진할 수 있으며, 상승된 염증은 무균(germ free) 상태에서 제거되거나 감소됨이 실험적으로 검증되었다. 따라서, 장내 미생물균총의 불균형을 억제함으로써 염증성 장 질환, 더 나아가 염증성 대장암을 예방하거나 치료할 수 있는 치료제 개발에 주목할 필요가 있다. 

제브라피쉬 동물모델은 유전적으로 다루기 쉬워 녹아웃 및 형질전환 동물모델에 제작에 용이하고 광학적으로 투명하기 때문에 고해상도 in vivo 이미징이 가능하다. 또한 해부학적으로나 기능적으로 인간 장과 유사하고 장내 미생물군과 미생물군의 개별 또는 집단 기능을 조사하기 위해 확립된 무균 실험 및 장내 미생물균총 분석등이 가능하다는 장점을 지니고 있다[10, 11].

기존의 여러 선행연구 자료 통해 TP53 돌연변이와 장내 미생물균총의 불균형은 각각 CAC의 발병 기전에 중요한 원인임이 밝혀져 있으나, CAC 발병과정 동안 기주의 TP53 돌연변이와 장내 미생물균총 사이의 상관관계에 대해서는 아직까지 알려진 바 없었다. 본 연구는 tp53 돌연변이와 장내 미생물총 사이의 상호작용을 제브라피쉬 치어모델을 활용하여 연구하였다. 


연구결과

1. tp53 돌연변이에서 장내 면역반응 증가 및 장내미생물총의 불균형 관찰

장내염증 조절에서 tp53 돌연변이와 장내미생물총의 상호작용을 관찰하기 위해 제브라피쉬 Tg(NFκB:EGFP)  형광형질전환체를 사용하여 장내미생물이 있는 유균 조건(CR)과 무균 조건(GF)에서 tp53 돌연변이 제브라피쉬 치어의 장내 염증상태를 조사하였다. Tg(NFκB:EGFP)는 NFkB 신호 활성을 측정할 수 있는 리포터 형질전환 제브라피쉬이다. 야생형에 비해 tp53 돌연변이체에서 증가된 NF-κB-EGFP 신호가 관찰되었고, 세균이 없는 무균 조건에서는 NF-κB-EGFP 신호가 줄어들어 야생형 제브라피쉬 치어와 차이가 없는 것을 확인할 수 있었다 (그림2).
 
그림 2. (A, B) 유균조건, 무균조건에서 장내 염증반응을 NF-kB:EGFP 형질전환 제브라피쉬를 이용해 관찰 (A) 및 정량 (B)


이는 유균조건의 tp53 돌연변이체의 장내 미생물균총이 염증 증가에 유발하였음을 의미하며, 원인이 되는 장내 미생물균총의 변화를 찾기 위해 16s rRNA 염기서열분석을 진행하였다. 그 결과 tp53장내 미생물균총의 수가 감소해 있었고, 특정 박테리아가 증식해 있는 장내 미생물균총의 불균형을 관찰 할 수 있었다 (그림3 A, B).  추가 분석을 통하여 장내미생물총의 불균형을 유발하는 원인 박테리아 중 하나로 Aeromonas jandaei를 동정할 수 있었는데, 기회병원성 공생미생물 (pathobiont) 중 하나인 A.  jandaei 를 순수 분리하고 mcherry 형광단백질의 형질전환의 통해 표지한 후 제브라피쉬 치어에 노출하면 tp53 돌연변이 제브라피쉬 치어의 장내에 더 잘 정착하는 것을 in vivo 상에서 확인 할 수 있었다 (그림 3 C, D).

그림 3. (A) 야생형, tp53 돌연변이의 장내 미생물균총 분석(16s rRNA sequencing). (B) 장내 미생물균총 분석에 대한 주요인분석 비교. (C, D) 야생형, tp53 돌연변이에 따른 mcherry 표지된 A. jandaei의 장내 정착 관찰 (C) 및 정착비율 정량 비교 (D) 


2. tp53 돌연변이에 의해 발생하는 시알산 대사의 불균형은 기회병원성 공생미생물의 증식 유발 

기회병원성 공생미생물인 A. jandaeitp53에서 더 잘 증식하는 원인을 찾기 위해 제브라피쉬 치어 장의 전사체 분석을 진행하였다. 박테리아 유무와 tp53돌연변이에 따른 전사체 분석결과, tp53돌연변이에 의해 많은 종류의 장내 대사관련 유전자군의 변화과 관찰되었고, 그 중 단분자지방산 대사와 시알산 대사 관련 유전자들이 크게 변화하였다(그림 4). GC-MS를 활용하여 단분자지방산관련 대사산물인 acetate, propionate, butyra를 측정하였을 때 tp53돌연변이와 야생형 간에 큰 차이를 보이지는 않았던 반면 (data not shown), HPLC-FLD를 활용하여 장내 시알산 대사를 측정해 보았을 때 tp53돌연변이에서 시알산 대사 물질 중 하나인 Neu5Gc가 증가해 있는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 무균조건에서도 Neu5Gc가 여전히 증가해 있는 것으로 보아 시알산 대사의 변화는 박테리아 유무와 상관없이 tp53 돌연변이에 의해서 발생하는 것이라고 생각할 수 있었다. 또한 in vitro culture assay를 통해 A.  jandaei는 이러한 Neu5Gc만을 선택적으로 이용하는 세균임을 확인하였다.

그림 4. (A, B) 박테리아 존재 유무에 따른 야생형, tp53 돌연변이 제브라피쉬 장의 전사체 분석(A) 및 DEG 분석(B). (C, D) 유균조건(C) 및 무균조건(D)에서 KEGG pathway 비교 분석
 


그림 5. (A, B) HPLC-FLD를 이용해 유균 조건(A), 무균조건(B)에서 장내 시알산 농도 측정. (C, D) 시알산 종류에 따른 A. jandaei 성장곡선(C) 및 정량(D)


3. 시알산 분해효소 저해제를 활용하여 기회병원성 공생미생물의 증식 억제 및 장염증 반응 완화 확인 

지금까지 연구를 통해 밝혀진 tp53 돌연변이에 의한 장내 미세환경과 장내 미생물균총의 변화를 바탕으로, A. jandaei의 증식에 중요한 장내 시알산 대사의 변화와 같은 기회병원성 대사를 이용하지 못하도록 한다면 기회병원성 공생미생물인 A. jandaei의 증식을 억제하고 장염증 반응을 완화할 수 있을 것이라는 가설을 세웠다. A. jandaei가 시알산 대사를 진행하기 위해서는 당사슬에서 시알산을 유리(free)하는 과정이 필수적인데, 이때 중요하게 작용하는 효소가 시알산 분해효소(sialidase)이다. 따라서 대표적으로 잘 알려진 FDA 승인 약물인 oseltamivir (상품명 : tamiflu)와 천근발의 뿌리에서 유래한 필리핀A 와 같은 시알산 분해효소 저해제(sialidase inhibitor)를 처리하여 장내 시알산의 가용성(availability)를 억제함으로써, A. jandaei의 세균수와 장내의 염증반응을 획기적으로 줄일 수 있다는 점을 확인하였다 (그림 6).
 
그림 6. (A-C)타미플루(Oseltamivir)의 약효 평가. 타미플루 처리시 (A, B) NF-kB염증반응 감소 (A, C) A. jandaei의 세균 수 감소


연구의 성과 및 의의

tp53 돌연변이의 새로운 기능 규명
: 장염증 및 염증성 대장암과 관련된 질병의 원천 연구 활용 

tp53 은 DNA가 손상된 세포가 악성으로 변질되지 않도록 세포 주기를 멈추게 하거나 세포 사멸을 유도하게 하는 암 억제 인자로 잘 알려져 있다. 기존의 기능과 더불어, 본 연구를 통해 염증성 대장암의 초기 위험인자인 tp53 돌연변이가 시알산 대사를 조절하여 장내 시알산 농도를 증가시킴으로써 장내미생물균총 불균형과 염증성 기회병원성 공생미생물의 비정상적 증식을 통한  장염증을 유발하고, 더 나아가 궁극적으로 대장암을 유발시킬 수 있다는 새로운 작용기전을 제브라피쉬 동물모델을 통해 규명하였다. tp53 유전자는 크론병, 궤양성 대장염, 염증성 대장암 등과 같은 다양한 장 질환에서 염증반응을 조절한다는 보고가 있으며, 본 연구를 바탕으로 tp53 돌연변이와 다양한 염증성 장질환의 관계를 규명하는 원천 연구로 활용될 수 있기를 기대한다. 
 

그림 7. tp53 돌연변이에 의한 장내미생물총의 불균형 및 시알산 분해효소 저해제의 효과에 대한 흐름도


▶ 시알산 분해효소 저해제의 새로운 사용법 발견 
: 장염증 및 염증성 대장암과 관련된 질병의 치료제 개발 

oseltamivir는 기존에 인플루엔자 바이러스의 시알산 분해효소인 Neuraminidase(viral sialidsae)를 억제하는데 유효한 약물로 대표적인 항바이러스 치료제로 알려져 있다. 본 연구에서는 tp53 돌연변이에 의한 장내 시알산 농도의 증가 기전연구를 통해 적절한 시알산 농도가 장내 염증 반응 및 염증성 대장암에 중요하다는 점에서 착안하여, 항바이러스제인 oseltamivir와 같은 시알산 분해효소 저해제의 장내 염증반응의 치료제로서의 사용가능성을 제시하였다. 또한 세균의 시알산 분해효소를 타킷으로 하는 천근발 뿌리에서 유래한 필리핀A라는 물질 또한 원인공생세균의 수와 장내 염증반응을 효과적으로 제어할 수 있음을 검증하였다. 본 연구는 장염증 및 염증성 대장염과 관련된 다양한 질병의 예방할 수 있는 치료제 기술 개발에 새로운 가능성을 제시하고 있다. 


참고문헌
1. Beaugerie L, Itzkowitz SH: Cancers complicating inflammatory bowel disease. N Engl J Med 2015, 372:1441-1452.
2. Lasry A, Zinger A, Ben-Neriah Y: Inflammatory networks underlying colorectal cancer. Nat Immunol 2016, 17:230-240.
3. Taniguchi K, Karin M: NF-kappaB, inflammation, immunity and cancer: coming of age. Nat Rev Immunol 2018, 18:309-324.
4. Hussain SP, Amstad P, Raja K, Ambs S, Nagashima M, Bennett WP, Shields PG, Ham AJ, Swenberg JA, Marrogi AJ, Harris CC: Increased p53 mutation load in noncancerous colon tissue from ulcerative colitis: a cancer-prone chronic inflammatory disease. Cancer Res 2000, 60:3333-3337.
5. Cooks T, Pateras IS, Tarcic O, Solomon H, Schetter AJ, Wilder S, Lozano G, Pikarsky E, Forshew T, Rosenfeld N, et al: Mutant p53 prolongs NF-kappaB activation and promotes chronic inflammation and inflammation-associated colorectal cancer. Cancer Cell 2013, 23:634-646.
6. Itzkowitz, Harpaz: Diagnosis and management of dysplasia in patients with inflammatory bowel diseases. Gastroenterology 2004, 126:1634-1648.
7. Chen J, Pitmon E, Wang K: Microbiome, inflammation and colorectal cancer. In Seminars in immunology. Elsevier; 2017: 43-53.
8. Carding S, Verbeke K, Vipond DT, Corfe BM, Owen LJ: Dysbiosis of the gut microbiota in disease. Microb Ecol Health Dis 2015, 26:26191.
9. Lynch SV, Pedersen O: The Human Intestinal Microbiome in Health and Disease. N Engl J Med 2016, 375:2369-2379.
10. Roeselers G, Mittge EK, Stephens WZ, Parichy DM, Cavanaugh CM, Guillemin K, Rawls JF: Evidence for a core gut microbiota in the zebrafish. ISME J 2011, 5:1595-1608.
11. Melancon E, Gomez De La Torre Canny S, Sichel S, Kelly M, Wiles TJ, Rawls JF, Eisen JS, Guillemin K: Best practices for germ-free derivation and gnotobiotic zebrafish husbandry. Methods Cell Biol 2017, 138:61-100.

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