생화학분자생물학회

클론 계통추적과 암의 진화

(Clonal lineage tracing and cancer evolution)

염민규: KAIST 의과학대학원 (minkyu.yum@kaist.ac.kr)

1. 서론 

 전통적으로 암의 진행 과정은 다윈식 선택(Darwinian selection)에 의해 유전적 변이가 단계적으로 축적되는 다단계적 과정으로 이해되고 있다 (1, 2). 즉 돌연변이가 발생하고 그 돌연변이를 지닌 세포들의 집합인 클론(clone)이 팽창하는 일련의 과정의 반복을 통해 종양이 점차 악성화되는 특성을 획득한다고 본 것이다. 시간이 지남에 따라 적합도(fitness)가 가장 높은 클론이 주변의 경쟁 클론들을 밀어내고 종양을 지배하게 되며, 그 결과 빠른 세포분열능이나 높은 전이성과 같은 악성 형질을 갖춘 세포군이 선택되고 우세해진다 (3, 4). 이러한 클론 진화(clonal evolution) 개념 하에서 최근 새롭게 주목받는 사실은 정상 조직에도 암 관련 돌연변이를 지닌 세포 클론들이 광범위하게 축적되고 있다는 것이다 (5, 6). 피부와 식도, 장 상피 등을 포함하는 다양한 상피 조직에서 암 주요 돌연변이(driver mutation)를 지닌 클론들이 중년 이후 급격히 늘어나 전체 조직을 모자이크처럼 뒤덮지만, 이들 중 대부분은 암으로 진행하지 않은 채 정상 세포들과 공존하고 있다는 사실이 밝혀졌다 (7-10). 이처럼 정상 조직에 나타나는 필드 암화(field cancerization) 현상은 암이 발생하기 이전 단계에서부터, 하나의 장기 내에 다수의 돌연변이 및 정상 클론들이 서로 경쟁과 상호작용을 통해 진화적으로 공존하고 있음을 시사한다. 이러한 돌연변이 클론들의 발생과 상호작용, 그리고 진화과정은 암 발생 초기 단계에서부터 진행 및 전이에 이르기까지 암의 성장 패턴, 이질성, 전이성, 치료 반응성 등에 큰 영향을 주는 것으로 알려져 있다 (11-13). 본 기고에서는 다양한 클론의 동적인 진화과정을 이해하기 위해 발전해 온 계통추적(lineage tracing) 기술들과 모델들을 살펴본 후, 클론 간 상호작용의 다양한 예시들을 소개하고, 이를 통해 암의 발생 및 진행 과정 전반에서 클론 진화 현상이 가지는 의미를 살펴보고자 한다.

2. 본론 

암의 진화 과정: 고전적 모델과 새로운 발견

 클론 진화의 개념은 1970년대 Peter Nowell의 보고 이후 암 생물학의 근간을 이루는 이론으로 자리 잡았다 (14). Armitage & Doll의 다단계 발암 모델이나 Vogelstein의 단계적 대장암 진행 모델이 그 고전적 예시들이다 (1, 15). 그러나 최근 차세대 시퀀싱(next generation sequencing) 기술과 단일세포 분석 기법(single cell analysis)이 발전하면서, 실제 종양 및 클론의 진화 양상이 단순한 선형적 돌연변이 축적 모델만으로는 충분히 설명되지 않는다는 사실이 드러나고 있다. 잘 알려진 종양 내 이질성(intratumor heterogeneity) 뿐만 아니라 (3, 4), 다양한 돌연변이 클론들이 중립적으로 진화하는 중립진화(neutral evolution) 모델이나 (16), 초기 클론들의 대규모 확장을 설명하는 빅뱅(Big Bang) 모델 (17), 염색체 불안정성 등에 의해 특정 시점에 돌연변이의 폭발적 증가가 관찰되는 단속평형(punctuated equilibrium) 모델 (18) 등이 보고되었다 (그림 1A). 

또한 최근 정상 장기에서도 수많은 돌연변이 클론이 이미 자리 잡고 있다는 사실이 확인되면서 (19), 1950년대 두경부암 연구에서 (20) 제안되었던 필드 암화라는 개념이 분자 수준에서 재조명되고 있다. 조직학적으로는 정상인 피부와 식도 상피에 NOTCH1, TP53 등 암 주요 돌연변이를 지닌 클론들이 나이가 들어 감에 따라 상피의 대부분을 대체할 수 있음이 보고되었으며 (5, 6), 대장 상피에서도 축적된 체세포 변이가 유사한 공간적 모자이크를 이룬다는 사실이 밝혀졌다 (8). 이 밖에도 간, 폐, 자궁, 방광, 위 등 다양한 상피 조직에서 암 주요 돌연변이를 지닌 클론들이 정상 조직에서 발견되어 (10, 19), 정상 조직은 본래부터 다양한 클론들로 구성된 체성 모자이시즘(somatic mosaicism) 상태이며, 암은 그 중 일부 클론이 주도권을 가지게 되는 연속적이고 비선형적인 진화의 결과임을 알 수 있다 (그림 1B).

이처럼 보이지 않는 클론의 진화를 움직이는 동력은 세포 간 상대적 적합도에 기반한 클론 경쟁 현상이다 (12). 초파리 날개 연구의 Myc 과발현에 따른 세포 경쟁 연구에서 정립된 바와 같이 (21, 22), 상대적 적합도가 월등한 암 주요 돌연변이 클론은 포유류의 조직 내에서도 슈퍼-컴페티터(super-competitor)가 되어 정상 세포를 밀어내고 클론의 영역을 확장한다 (23). 흥미롭게도 이러한 클론 간 경쟁은 양면성을 가지고 있다. 발암성 클론이 분비하는 성장인자에 반응한 정상 세포들이 발암성 클론을 제거하여 조직 항상성을 유지하기도 하고 (24), 발암성은 낮지만 클론 경쟁력이 더 높은 이종의 변이 클론이 미세 종양을 경쟁적으로 제거하는 경우도 최근 보고된 바 있다 (25). 이는 조직 내 클론 경쟁이 실질적인 암 억제 메커니즘으로 기능함을 의미한다. 결국 정상 조직은 상황에 따라 암을 촉진하기도, 억제하기도 하는 역동적 경쟁의 장이라고 볼 수 있는 것이다. 주요 돌연변이 클론이 궁극적으로 암으로 진행될지 여부는 조직의 종류, 돌연변이 스펙트럼, 조직 미세환경, 초기 클론들의 구성비 등 복잡한 요인에 따라 달라질 수 있다. 이처럼 클론들의 비선형적 진화 양상은 실제 암 발생과 진행과정이 기존의 돌연변이 축적모델 만으로는 설명하기 어려우며, 각 개별 돌연변이 클론들을 다양한 방식으로 표지하여 장기간 운명을 추적하는 계통추적 기술과 모델시스템을 통해 암의 클론 진화 과정을 연구할 필요성을 시사한다.

계통추적 기술의 발전

클론 단위에서 세포의 움직임과 운명을 추적하려면, 개별 클론을 식별하고 장기간 추적할 수 있는 기술이 필수적이다. 지난 수십 년 간 발전해 온 계통추적 기법들은 정상 조직과 종양에서 클론의 진화적 동태를 밝히는데 핵심적인 역할을 해왔다 (26). 대표적으로, Cre-LoxP 재조합 시스템을 이용한 유전자 기반 형광표지 기술은 살아있는 개체에서 극소수의 세포에 유전자 수준의 영구적인 표지를 남김으로써 해당 클론의 자손(clonal progeny)을 조직 내에서 추적할 수 있다. 특히 여러 형광단백질을 활용할 수 있는 Confetti 생쥐모델 (27)을 활용하면 하나의 조직 안에 서로 다른 색으로 표지 된 다수의 클론을 동시에 관찰할 수 있어, 클론 동태 변화와 경쟁 결과를 한 눈에 분석하는 것이 가능하다 (그림 2A, 2B) . 정상 세포 유래의 클론과 암 돌연변이 클론을 동시에 추적할 수 있는 다중 색 계통추적 생쥐모델도 개발되었다. 해당 Red2Onco 생쥐모델 (28)을 이용한 최근 연구에서는, 장 상피 조직에서 종양유전자(oncogene) 변이가 있는 클론이 주변 미세환경을 조절하여 인접한 정상줄기세포 활성을 억제한다는 사실이 밝혀졌다. 즉, 암 돌연변이 클론이 주변 조직의 미세환경을 자신에게 유리한 방향으로 재편성하여 진화적 경쟁 우위를 확보하는 과정을 보여준 사례인 것이다. 

유전적 바코드 삽입 기법이 발전하면서, 하나의 종양으로부터 수천에서 수만 개 클론을 동시에 추적하는 것도 가능하다 (그림 2C). 대표적으로 CRISPR-Cas9로 바코드를 누적하여 계통도를 그리는 방식의 GESTALT, MEMOIR, LINNAEUS, ScarTrace, scGESTALT, CARLIN, DuTracer 등과 같은 방법론이나 (29, 30), 렌티 바이러스 및 트랜스포존을 이용해 고유 바코드를 삽입하는 ClonTracer, CellTag, LARRY 등의 대량 세포바코딩 (31), 그리고 세포가 고유하게 가지고 있는 체세포 돌연변이 자체를 내재적 바코드로 활용하여 계통을 복원하는 방법들 (32, 33)까지 다양한 방법론들이 등장하고 있다. 이러한 분자수준의 해상도를 바탕으로 하는 계통추적 기법들은 암의 발생 및 진행 과정 동안의 수많은 클론들의 경쟁 및 협력 동태를 시간과 공간 차원에서 정량화 할 수 있게 함으로써, 동물 모델을 넘어 실제 환자 조직에서도 복잡한 클론 진화 패턴을 직접 검증할 수 있는 길을 열었다 (31). 최근에는 클론들이 단순히 DNA 서열의 차이뿐만 아니라, 비유전적인(non-genetic) 표현형 가소성(phenotypic plasticity)을 포함하는 개념까지 확장되고 있기도 하다 (34). 이처럼 첨단 계통추적 기술을 통해 이제는 암 발생 및 진행 과정에서 다양한 클론들이 상호작용하는 동적 과정을 정량적으로 규명할 수 있게 되었으며, 정상 조직과 변이 클론 간 경쟁의 결과가 암의 진화과정에 미치는 영향을 실험적으로 밝혀낼 수 있는 기반들이 마련되고 있는 것이다.

클론 상호작용: 경쟁, 공존, 협력

암이 일단 형성되고 나면 내부에는 여러 유전적(genetic) 혹은 비유전적(non-genetic)으로 구별되는 하위 클론(subclone)들이 공존하며, 이들 사이의 관계가 종양의 성장 속도, 침습성 및 치료 반응성 등을 결정짓는 핵심 변수가 된다 (3, 35, 36). 최신 계통추적 및 단일세포 분석 연구에 따르면, 이 생태계는 클론들의 경쟁, 중립적 공존, 협력이 끊임없이 이루어지는 복잡한 네트워크를 이루는 것으로 보인다.

우선 선택 압력이 강한 환경에서는 종양 초기에 관찰되는 다클론성(polyclonality) 특징이 시간에 따라 적합도가 더 높은 하나의 클론으로 점차 수렴할 수 있다. 이러한 클론 병목현상(clonal bottleneck)에 의해 (37), 클론 경쟁에 이점을 가진 한 클론이 수백 개의 경쟁자를 밀어내면서 단일 지배(monoclonal dominance) 클론이 형성될 수 있는 것이다. 반면 초기 대장암 연구에서 제시된 중립진화 모델이나 빅뱅 모델처럼 (16, 17), 여러 클론이 비슷한 적합도를 보이면 뚜렷한 선택 압력 없이 나란히 확장 및 공존하면서 높은 종양 내 이질성을 유지하기도 한다. 또한 서로 다른 하위 클론이 서로 성장 인자, 대사 산물 등을 주고받으며 집단 적응도를 끌어올리는 협력적 상호작용의 경우도 보고된 바 있다 (35, 38). 단일 클론만 존재하는 경우에는 암 성장의 한계를 보이다가, 서로 다른 클론들을 혼합할 시 증식이 가속화되고 전이율이 높아진 것이다. 이는 다양한 클론들이 생태학적인 개체성(ecological individuality)을 보이는 예시라고 하겠다. 즉, 암의 발생과 진행은 개별 세포의 돌연변이 축적만으로 이루어지는 것이 아니라 동일한 공간을 공유하는 세포 집단들의 경쟁과 협력이라는 진화적 상호작용의 결과로 이해해야 한다 (39). 만일 각 클론들의 운명을 미리 예측할 수 있다면, 발암성이 높은 슈퍼-컴페티터 클론의 확산을 조기에 차단하거나, 발암성은 낮지만 진화적 경쟁력이 강한 클론을 이용해 발암성 클론을 견제하는 생태학적 개입이 가능해질 수 있다.

이러한 클론 상호작용의 역학이 임상 전략의 변수로 이어진 일부 예시가 보고된 바 있다. 적응 치료(adaptive therapy)가 대표적인데, 항암제 내성 클론의 급속한 확산 및 단일 지배를 막기 위해 항암제에 민감한 클론을 완전히 없애지 않고 일부 남겨두는 것이다. 이를 통해 항암제 투여 이후에도 클론 간 경쟁상황을 유지함으로써 재발 시간을 지연시키고자 하는 접근이다 (40, 41). 클론-미세환경 간 협력 고리를 차단해 집단 적응도를 낮추는 전략이나, 발암성이 낮은 클론의 적합도를 인위적으로 높여 고위험 클론을 생태적으로 압박하는 전략이 추가적인 예시가 된다 (23, 42, 43). 이렇게 다양한 클론들의 상호작용은 상호 배타적인 갈래가 아니라 하나의 연속체로 존재할 것으로 생각되며, 각 종양별, 시간별, 심지어는 치료에 의한 선택 압력에 의해서 그 위상이 끊임없이 변화한다 (44). 따라서 암의 발생과 진행과정에서의 클론 생태계를 보다 잘 이해하기 위해서는 유전적 계통도에만 머물지 않고, 단일세포 및 공간전사체 데이터를 통합하여 클론-미세환경 상호작용 네트워크의 동적인 변화를 파악해야 한다 (31). 이와 같은 통합적 시각은 이제 ‘어떤 돌연변이를 겨냥할 것인가’를 넘어 ‘어떤 클론-미세환경 관계망을 교란할 것인가’라는 새로운 암 정밀의료 전략을 설계하는 토대가 될 것이다.

3. 결론 및 미래 전망

암을 클론 진화의 관점에서 이해하는 것은 암 생물학의 필수적인 패러다임으로 자리매김하고 있다 (2). 본 기고에서 살펴본 바와 같이, 정상 조직 단계부터 존재하는 광범위한 필드 암화 현상, 종양 내부의 복합적 클론 진화 과정, 그리고 다양한 클론들이 미세환경과 함께 구성하는 생태학적 네트워크는 종양 이질성과 치료 실패의 근본 원인을 설명한다 (36). 최근 개발되고 있는 다중 색 계통추적 모델, CRISPR 및 체세포 변이 기반의 고해상도 바코딩, 단일세포 및 공간전사체(spatial transcriptomics) 분석 등의 기술적인 도약은 조직의 공간적 맥락에서 클론과 암의 진화 과정이라는 복잡계를 정량적으로 해부할 수 있는 기술적 기반을 제공하고 있다 (31). 결론적으로, 암의 발생 및 진행 과정에 내재한 복잡한 클론-미세환경 상호작용과 그 비선형적 진화과정을 면밀히 이해하는 것이 필요하다 (45). 계통추적 기술과 단일세포 및 공간오믹스 분석의 접목으로 암의 발병부터 치료 반응에 이르는 과정을 포괄적으로 해석할 수 있게 된 지금, 암은 이제 개별 세포 유래의 질병이 아닌 다양한 클론들의 경쟁과 공존의 산물로 인식되어야 할 것이다. 이러한 통합적 연구는 향후 클론 생태계 및 진화과정을 표적화하는 새로운 정밀의료의 방향성이 되리라 기대한다. 

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