생화학분자생물학회

​CRISPR RNP를 패키징한 바이러스 유사 입자(VLP)를 이용한 혁신적인 유전자변형 마우스 모델 제작 방법 개발

An innovative approach using CRISPR-ribonucleoprotein packaged in virus-like particles to generate genetically engineered mouse models

Nat. Commun. 16, 3451 (2025)

정태영: 서울대학교​ (j9t2y9@naver.com)

윤다은: 서울대학교​ (ekidmes@naver.com)

김솔빈: 서울대학교​ (kkssbb007@snu.ac.kr)

양지윤: 서울대학교​ (yunej7132@naver.com)

성제경: 서울대학교​ (snumouse@snu.ac.kr)

김경미: 서울대학교​ (kyoungmi_kim@snu.ac.kr)

연구배경

 생체 내 유전자 기능 분석과 유전질환 연구를 위한 유전자변형 마우스 모델(GEMMs)은 기초 및 응용 생명과학에서 핵심적인 연구 도구로 자리잡아 왔다 (1). 이러한 모델은 유전적 요인의 기능적 역할을 구체적으로 규명할 수 있는 플랫폼을 제공하며, 인간 질환을 모사하고 치료전략을 검증하는 데 필수적이다. 특히 최근에는 다양한 생리학적 경로와 세포 특이적 유전자 발현의 정밀한 조절이 가능해짐에 따라, 질환의 발생과 진행을 모사할 수 있는 마우스 모델에 대한 수요가 급증하고 있다.

 기존의 마우스 유전자 조작 방식은 ES 세포 기반의 표적화 전략이나 무작위 삽입형 transgenic 방식에 의존해 왔으나, 이들은 제작 기간이 길고 표적 특이성이 낮으며 높은 기술적 장벽을 요구한다. CRISPR-Cas9 시스템은 이러한 한계를 해결할 수 있는 획기적인 도구로 부상하였다 (2). 특히 sgRNA와 Cas9 단백질 복합체인 RNP 형태는 발현 지속 시간을 줄이고 오프타겟 위험을 최소화할 수 있어 생식세포 편집에 매우 적합하다. 그러나 이 RNP의 전달은 여전히 미세주입(microinjection)이나 전기천공(electroporation)에 의존하고 있으며, 이는 실험자의 숙련도와 고가 장비 의존성을 요구함은 물론, 배아 손상과 발달률 저하라는 문제점을 수반한다 (3, 4, 5, 6).

 이에 따라 비침습적이고 효율적인 대체 전달 기술에 대한 관심이 높아지고 있으며, 바이러스 유사 입자(VLP)는 이러한 요구를 충족시킬 수 있는 유망한 플랫폼으로 주목받고 있다. VLP는 감염성을 제거한 바이러스 외피 구조로 구성되어 있어 다양한 생체분자를 세포 내로 효과적으로 전달할 수 있다. 또한 구조적 안정성과 세포투과성, 생체적합성이 우수하여 단백질, RNA, RNP등 다양한 분자의 세포 내 전달에 적합하다 (7, 8).

 본 연구에서는 VLP 기반 전달 플랫폼을 활용하여, CRISPR RNP 복합체를 포장하고 이를 마우스 zygote와 IVF 과정에 공동배양함으로써 유전자 편집을 유도하는 CRISPR-VIM 기술을 개발하였다 (9).

 이 기술은 기존의 물리적 조작 없이 배양만으로 편집이 가능하다는 점에서 비침습적인 접근 방식을 실현하였고, 높은 유전자 편집 효율과 우수한 배아 생존률, 일관된 재현성을 동시에 확보하였다. CRISPR-VIM은 단순한 유전자 제거(knockout) 모델 제작뿐 아니라, ABE (Adenine Base Editor)를 활용한 A-to-G 치환, CBE (Cytidine Base Editor)를 이용한 C-to-T 변이 도입, 그리고 AAV 매개 HDR (Homology-Directed Repair)을 통한 외래 유전자 삽입(knock-in)까지 다양한 편집 전략에 성공적으로 적용되었다.

 특히 다중 유전자 편집 측면에서, 복수의 sgRNA를 하나의 VLP에 탑재하거나 서로 다른 VLP를 조합하여 동시 전달하는 전략이 가능하였다. 본 연구에서는 대표적으로 Plin1과 Gata3 유전자에 대한 동시 편집을 수행하였으며, 다중 편집 조건에서도 개별 유전자 각각에 대해 높은 수준의 편집 효율이 유지되었다. 다중 타겟 편집이 이루어진 배아는 발달률에서도 단일 타겟군과 유의한 차이를 보이지 않아, 효율성과 생존성을 모두 확보한 결과로 해석된다. 이러한 접근은 단일 유전자 분석을 넘어 복합 유전자 간 상호작용 규명, 복합형 질환 모델 제작, 조직 공학적 재구성 등 고차원적 생명과학 응용에 중요한 기술적 기반을 제공할 수 있다. 뿐만 아니라, Tyr 유전자의 ABE 기반 편집을 통해 coat color 표현형이 가시적으로 변화된 히말라얀 마우스 모델을 제작함으로써, VLP 전달이 기능적 표현형 유도에도 충분하다는 점을 실증하였다.

 이와 같은 결과는 VLP 기반 CRISPR 전달 기술이 다양한 유전자 편집 도구와 조합될 수 있으며, 마우스 배아 단계에서의 정밀한 유전자 조작이 가능함을 보여준다. 궁극적으로 본 연구는 유전자 편집 효율의 향상, 실험 재현성의 확보, 기술적 접근성의 확대라는 측면에서 기존 GEMMs 제작 기술의 한계를 뛰어넘는 실용적이고 확장성 높은 플랫폼을 제시하였으며, 향후 중대형 동물모델, 환자 맞춤형 질환 모델, 유전자 치료 응용 등 다양한 분야에서 파급력 있는 활용이 가능할 것으로 기대된다.

연구결과

1. VLP 구조 설계 및 RNP 전달 최적화

 먼저 MMLV(murine leukemia virus) 기반 Cas9, ABE8e, AncBE4max 등 다양한 유전자가위 단백질을 sgRNA와 함께 효율적으로 패키징할 수 있는 VLP 시스템을 구축하였다. HEK293T, ARPE19, Neuro-2a, mESC 등 다양한 세포주를 대상으로 한 실험에서 VLP에 의한 유전자 편집 효율을 평가하였고, ABE8e는 98%, SpCas9은 99% 이상의 높은 효율을 보였다 [그림 1].

그림 1. VLP를 이용한 Neuro-2a세포에서의 유전자 편집효율.

 처리 조건 최적화 실험에서는 VLP 농도(10%, 20%) 및 시간(0~20시간)을 조절하였으며, 20% 농도에서 20시간 처리한 조건에서 가장 우수한 효율과 생존률이 관찰되었다 [그림 2].

그림 2. VLP 공배양시간 및 비율 최적화.

2. Plin1 Knockout 마우스 모델 제작

 SpCas9을 탑재한 VLP를 마우스 수정란에 적용하여 Plin1 유전자의 2번째 엑손에 29 bp 결실을 유도하였다. 편집된 F0 개체를 교배하여 F1 및 F2 세대까지 안정적인 세대간 전달(germline transmission)을 확인하였고 [그림 3], PLIN1 단백질의 결손은 지방조직의 면역형광 염색 및 western blot을 통해 검증되었다. 조직학적 분석에서는 지방세포의 크기 감소 및 대식세포 침윤 증가 등의 표현형이 나타났다.

그림 3. VLP를 이용한 Plin1 Knock out mouse 제작 및 분석

3. IVF 시스템 내 CRISPR-VIM 적용

 CRISPR-VIM 플랫폼의 실제 생명과학 실험 환경에서의 적용 가능성을 평가하기 위해, 본 연구에서는 체외수정(in vitro fertilization, IVF) 시스템에 CRISPR-VIM을 결합하는 전략을 시도하였다. 이를 통해 기존의 미세주입 없이도 배아 발달 과정에서 유전자 편집이 가능한지를 확인하였다. 연구진은 정자 처리 전, 정자와 난자의 수정 직후, 수정 후 배양 단계 등 다양한 시간 지점에서 VLP를 처리하여 편집 효율과 배아 발달률을 비교하였다.

 그 결과, 수정 후 배양 단계에서 VLP를 처리했을 때 가장 높은 편집 효율과 안정적인 배아 발달률이 관찰되었다. ABE8e가 탑재된 VLP를 이용해 Gata3와 Plin1 유전자를 표적으로 A-to-G 교정을 유도한 결과, 각각 76.7%, 81.9%의 높은 교정 효율을 보였다. 특히, VLP 처리군에서도 높은 생존률과 정상적인 발달이 관찰되었다 [그림 4].

그림 4. IVF 과정 내 VLP 도입 조건 최적화

 특히 Tyr H420R의 교정을 통해 히말라야 표현형을 가진 마우스를 얻고, 이를 F2 세대까지 교배하여 표현형의 안정적 유전을 확인하였다.

그림 5. IVF 시스템 내 CRISPR-VIM 적용을 통한 마우스 모델 제작

 이러한 결과는 CRISPR-VIM 시스템이 기존의 미세주입 또는 전기천공 방식 없이도 IVF와 결합하여 유전자변형 배아를 효과적으로 생산할 수 있음을 시사한다. 따라서 본 플랫폼은 접근성과 재현성이 뛰어나고, 고속 대량 처리가 가능하다는 점에서 미래의 유전자교정 동물모델 생산에 매우 유용한 기술로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

4. CBE 최적화 및 효율 향상

 초기 실험에서 AncBE4max를 탑재한 VLP는 C-to-T 염기 교정에서 낮은 편집 효율을 보였다. 이를 해결하기 위해 연구진은 VLP의 포장 효율을 개선하고자 gag 유전자를 codon 최적화하여 gag-CBE 단백질의 발현량을 증가시켰다. 이는 더 많은 양의 RNP 복합체가 VLP 내에 효율적으로 패키징되도록 하여, VLP 한 입자당 CBE RNP 단위의 수를 높이는 데 기여하였다. 그 결과, 대부분의 유전자에서 AncBE4max-VLP는 기존 대비 유의하게 향상된 C-to-T 교정 효율을 보였으며, 다양한 실험 조건에서 안정적인 편집 결과를 나타내었다 [그림 6]. 배아 수준에서도 해당 VLP는 정상적인 발달을 유도하였다. 이처럼 gag codon을 최적화함으로써, CBE 효율과 안전성을 동시에 개선하였다.

그림 6. WT CBE와 최적화된 CBE의 유전자 편집 효율 비교

5. HDR 기반 Knock-in 모델 제작

 HDR(homology-directed repair)을 기반으로 한 knock-in 모델 제작을 위해, 연구진은 self-complementary AAV6 (scAAV6) 벡터에 donor DNA를 탑재하고 이를 CRISPR-VIM과 함께 생쥐 배아에 처리하는 전략을 적용하였다. Cas9-RNP가 유전자 절단을 유도하고, AAV6에서 전달된 donor DNA가 해당 부위에 정밀하게 삽입되도록 유도함으로써 HDR 기반 교정이 유도된다.

 첫 번째 모델에서는 Tyr 유전자 내 EcoRI 제한효소인식서열 삽입을 목표로 하여, 유전자 절단과 AAV6 전달을 동시에 수행하였다. 그 결과, PCR 및 제한효소 분석을 통해 정확한 서열 삽입이 확인되었다. 두 번째 모델에서는 Kcnq4 유전자의 3' 말단에 728 bp 길이의 인간 유래 서열을 knock-in하여 humanized mouse 모델을 제작하였다. 이 개체는 F1, F2 세대까지 안정적인 유전이 확인되었으며, HDR 기반 편집이 생식세포(germline transmission)까지 효과적으로 유지될 수 있음을 입증하였다 [그림 7].

그림 7. CRISPR-VIM을 이용한 KCNQ4 인간화 마우스 제작

 본 실험은 CRISPR-VIM 시스템이 HDR 경로를 통한 knock-in에도 적용 가능하다는 것을 보여주며, 정밀 서열 삽입을 필요로 하는 정밀 질환 모델 제작에 활용될 수 있는 가능성을 제시하였다

5. 다중 유전자 동시 편집

 CRISPR-VIM을 활용하여 여러 유전자를 동시에 타겟팅하는 전략도 시도하였다. 하나의 VLP에 두 개의 sgRNA를 탑재하는 Combi 전략, 각 sgRNA를 별개의 VLP로 나누어 처리하는 Double/Triple 전략, Cas9, ABE, CBE를 모두 포함한 Quadruple 전략이 설계되었다. 세포 수준에서는 Fgfr3, Gata3, Kcnq4, Dnmt1 등의 유전자에서 각각 최대 88.7%의 편집 효율이 나타났고, 배아에서도 일부 개체에서 두 유전자 이상의 동시 편집이 관찰되었다. F1 및 F2 세대 분석을 통해 세대간 전달도 확인하였다 [그림 8].

그림 8. CRISPR-VIM을 이용한 다중유전자 편집

연구성과 및 의의

 본 연구는 CRISPR-Cas 기반 유전자 편집 기술을 바이러스 유사 입자(VLP)에 융합하여 비침습적이고 고효율적인 유전자가위 전달 플랫폼인 CRISPR-VIM(CRISPR-VLP-Induced Mutagenesis)을 구축함으로써, 생쥐 유전자 변형 모델 제작의 새로운 패러다임을 제시하였다 [그림 9]. 기존의 미세주입이나 전기천공 방식과 달리, 본 시스템은 복잡한 장비나 숙련된 기술 없이도 배아에 유전자가위를 효과적으로 전달할 수 있어 접근성을 획기적으로 향상시켰다. 

그림 9. CRISPR-VIM 모식도

(Created in BioRender. Kim, K. (2025) https://BioRender.com/x96o339)

 연구진은 Cas9, ABE, CBE 등 다양한 유전자가위 단백질을 sgRNA와 함께 하나의 VLP 내에 동시 패키징할 수 있도록 설계함으로써, 복합체 안정성과 전달 효율을 극대화하였다. 특히 gag 유전자에 대한 codon 최적화를 통해 Gag 단백질의 발현량을 증가시켜 RNP 복합체의 패키징 효율을 높였고, 이를 통해 단일 입자 내에서의 유효 복합체 밀도를 대폭 향상시켰다. 이러한 구조적 개선은 세포 수준뿐 아니라 배아 및 생체 내에서의 편집 효율 향상으로 이어졌다.

 또한 본 연구는 다양한 편집 전략을 폭넓게 적용하여 플랫폼의 유연성과 확장 가능성을 입증하였다. KO 모델로는 Plin1 유전자의 결실을 유도하여 생쥐의 지방조직 표현형을 규명하였고, BE 전략으로는 Gata3, Plin1, Tyr 등에서 A-to-G 또는 C-to-T 염기 교정을 유도하여 기능적 표현형과 안정적인 세대 유전을 확인하였다. HDR 기반 knock-in 전략에서는 AAV6 벡터를 활용해 Tyr 유전자 내 EcoRI 서열 삽입과 Kcnq4 유전자에 인간 서열 삽입을 성공적으로 수행하였고, IVF 시스템과의 결합을 통해 미세주입 없이도 유전자 교정 배아를 대량으로 생산할 수 있는 가능성을 제시하였다.

아울러, 하나의 플랫폼 내에서 multiple sgRNA와 유전자가위 종류를 조합한 다중 유전자 동시 편집 전략도 효과적으로 수행되어, 복잡한 유전자 조합의 동시 교정이 가능한 기술적 기반을 마련하였다. 이는 단일 유전자 이상에 국한되지 않고 복합 유전 질환 모델 제작 및 다중 유전자 네트워크 연구에 매우 유용하게 활용될 수 있다.

 종합적으로 본 연구는 RNP 기반 CRISPR 기술을 VLP 플랫폼과 융합하여 기술적 장벽을 낮추고, 다양한 유전자 편집 전략을 하나의 시스템으로 통합 가능하다는 점에서, 유전자 교정 기술의 실용적 전환을 위한 중요한 기술적 성과를 확보하였다고 평가된다. 특히 본 시스템은 향후 인간화 마우스 모델, 조직 특이적 전달, 중대형 동물 적용, 치료제 개발 등 후속 연구에도 높은 적용 가능성을 가지며, 유전자 교정 연구의 확장성과 현실 적용 가능성을 동시에 제시한다.

참고 문헌

1. Doudna, J. A. The promise and challenge of therapeutic genome editing. Nature 578, 229–236 (2020).

2. Wang, H. et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell 153, 910–918 (2013).

3. Wang, H. et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell 153, 910–918 (2013).

4. Hashimoto, M. & Takemoto, T. Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing. Sci. Rep. 5, 11315 (2015).

5. Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y., Modzelewski, A. J. & He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. J. Biol. Chem. 291, 14457–14467 (2016).

6. Fajrial, A. K., He, Q. Q., Wirusanti, N. I., Slansky, J. E. & Ding, X. A review of emerging physical transfection methods for CRISPR/Cas9-mediated gene editing. Theranostics 10, 5532–5549 (2020).

7. Banskota, S. et al. Engineered virus-like particles for efficient in vivo delivery of therapeutic proteins. Cell 185, 250–265 (2022).

8. Hamilton, J. R. et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 and transgenes enables complex immune cell engineering. Cell Rep. 35, 109207 (2021).

9. Jeong, T. Y. et al. An innovative approach using CRISPR-ribonucleoprotein packaged in virus-like particles to generate genetically engineered mouse models. Nat Commun. 16, 3451 (2025)